合成肽及包含其的疫苗制造技术

本发明专利技术涉及嵌合肽，所述的嵌合肽包括一或多个处于能进行免疫学相互作用构象中的保护性表位，本发明专利技术还涉及包括嵌合肽的疫苗。本发明专利技术特别涉及能诱导针对Ａ类链球菌的保护性抗体的嵌合肽。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及处于能进行免疫学相互作用的构象的含有一个或多个保护性表位的嵌合肽及包含其的疫苗组合物。本专利技术尤其指的是一种能诱导抗A类链球菌的保护性抗体的嵌合肽。此说明书中引用作者的文献的著录项目详见说明书最后部分。说明书中所述氨基酸序列号(SEQ ID NOs.)附后表明。在本说明书中，除非另有说明，术语“包括”是指包括所列的组分或组分组，也包括其它的组分或组分组。许多能用作抗一些疾病的疫苗候选者的蛋白质具有一种卷曲螺旋结构，其是在各种各样的蛋白质中发现的一种重要的结构和生物学高丰度的基序(Cohen and Parry，1990，1986)。已预计有200多种蛋白质含有卷曲螺旋区域(Lupas et al.，1991)，其中包括一些细菌的表面蛋白如链球菌A蛋白和M蛋白；病毒如流感血凝素和人免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白gp45；及原生动物如锥虫的VSG。所有卷曲螺旋基序均有特征性的7个氨基酸残基重复(a-b-c-d-e-f-g)n。一些卷曲螺旋区域的x线结构已经清楚，其包括酵母转录因子GCN4二聚体的亮氨酸拉链部分(O′Shea et al.，1991)，α-spectrin的重复基序(Yan，1993)，及GCN4亮氨酸拉链三聚体(Harburyet al.，1994)和四聚体(Harbuty et al.，1993)突变体。在基于这些蛋白质的亚单位疫苗的开发中，通常很难将表位定位在卷曲螺旋结构中。而且保护性表位需要以恰当的构象存在用以免疫识别，如与抗体结合。这一点在确定一个最小的稳定表位并用它作为疫苗中尤其重要。A类链球菌(此后称作“GAS”)是人体一些疾病的致病因素，能导致引起严重心脏疾患的急性风湿热。风湿热是一种由链球菌M蛋白与心脏抗原间的交叉相互作用引起的自身免疫疾病(Beachey et al.，1988)。M蛋白含周期性出现的7个残基强烈地暗示该分子的中心杆区呈一个卷曲螺旋构象(Manula and Ficshetti，1980)。跨越此区域的重叠肽已生产出(见国际专利申请PCT/AU93/00131 )，抗来自高度保守的C-末端区的一20mer合成肽(记作p145)的小鼠抗体能调理及杀死GAS的多倍分离物(Pruksakorn et al.，1994)。另外，p145能抑制人血清介导的体外杀伤。重要的是p145也可刺激诱导心脏交叉反应T细胞(Pruksakornet al.，1992；1994b)。p145中的B细胞表位被认为是参与构象的，因为截短的肽不能引起保护性抗体反应(Pruksakorn，1994)。因此就需要确定诱导调理抗体所需的p145的最小区域；其随后能构成疫苗的基础。此方法能从病原体的一系列蛋白质中识别出最小表位。定位抗原中的最小表位的一种已知方法是PEPSCAN法(Geysenet al.，1987)，但使用的短肽只能指示出顺序或连续表位。其它确定构象表位即由蛋白质的三级结构形成的表位的方法依赖于模拟表位(mimotope)法。模拟表位是能诱导抗体的表位模拟物。可在含有使用20个通用氨基酸生产的八肽的全部组成成份(即208肽)的聚丙烯小管中合成肽(Geyysen et al.，1987)。或者，可用抗体识别法测定由丝状噬菌体克隆的大量混合物组成的、每个成员在病毒颗粒表面显示一种肽序列的表位文库(Scott and Smith，1990)。根据本专利技术，衍生自一种构象表位的重叠肽被包含在一种具有相似天然构象的肽中。该方法能潜在用于定位一系列的构象表位，以及用于设计最小表位作为抗GAS和许多其它病原体的疫苗候选者。因此，根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种嵌合肽，其包括插入第二个氨基酸序列内的含一个构象表位的第一个氨基酸序列，其中所述的第一个和第二个氨基酸序列衍生自具有相似天然构象的肽、多肽或蛋白质。根据本专利技术的这一方面，第二个氨基酸序列组成一“构架肽”并为嵌合肽提供一种适当构象。选择的或遗传工程化的构架肽为第一个氨基酸序列提供一种相似构象如其天然存在的形式。在最优选的实施例中，构架肽呈一种α-螺旋卷曲螺旋构象，因此能用于使存在于第一氨基酸序列中的表位呈一种相似构象，如一种α-螺旋卷曲螺旋构象。根据本专利技术的优选方面，提供了一种嵌合肽，包括插入第二个氨基酸序列内的含一个构象表位的第一个氨基酸序列，其中所述的第二个氨基酸序列折叠成一种α-螺旋卷曲螺旋构象。本文中特别举例说明的是第一个氨基酸序列衍生自链球菌M蛋白并特别包括来自下列氨基酸序列(用单字母缩写表示氨基酸残基)的一个B细胞构象表位LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO1)或一个或多个这些氨基酸残基的功能和/或化学等价物。因此本专利技术的一个特别优选实施方案涉及一种嵌合肽，其包括至少有三个氨基酸选自下列序列的第一个氨基酸序列，LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO1)其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自链球菌M蛋白的构象B细胞表位；其中所述的第一个氨基酸序列被插入能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中。优选地，第一个氨基酸序列包括至少5个，更优选至少10个，最优选至少15个相邻的氨基酸残基。或者，可选择例如那些位于螺旋的外表面且为活性所需或能满足活性需要的非相邻的氨基酸。构架肽的结构基于7个氨基酸残基重复(a-b-c-d-e-f-g)n其中a和d位优选大的非极性残基，b、c及f位是极性和荷电的，e和g位一般适于链间离子的相互作用。一特别优选的构架肽基于与GCN4亮氨酸拉链(O′shea et al.，1989；1991)或其三聚体(Harbury et al.，1994)或四聚体(Harbury et al.，1993)及α-spectrin的重复基序(Yan，1993)相对应的肽的结构。GCN4亮氨酸拉链是较优选的，衍生自GCN4亮氨酸拉链肽的共有特征的模型七元重复包括以下序列VKQLEDK(SEQ ID NO2)其给出了一种4个七元重复的构架肽(GCN4)4。如果需要，该构架肽可以或需要比4个重复长一些。然后将第一个氨基酸序列嵌入卷曲螺旋构架肽形成嵌合肽。本专利技术的嵌合肽可通过重组方法生产或通过如使用固相肽合成技术以规定顺序分步添加一个或多个氨基酸残基而化学合成。肽可与其它蛋白质联合合成，然后经化学裂解而分离，或者肽或多价肽可经多个重复单位而合成。肽可包含天然存在的氨基酸残基也可含有非天然存在的氨基酸残基如某些D-异构体或经化学修饰的天然存在的残基。后述这些残基可以是例如促进或提供对肽的构象约束和/或限制所需的。生产本专利技术的肽的方法的选择取决于例如所需类型，肽的量和纯度以及生产的容易性和方便性等因素。本专利技术的嵌合肽在体内应用时首先需化学修饰，因为肽本身没有足够长的血清和/或组织半寿期。本专利技术的肽的化学修饰对改进其抗原性包括肽的某一区域作为B和/或T细胞表位的能力也有重要作用。这种经化学修饰的嵌合肽在此称为“类似物”。术语“类似物”包括本专利技术的嵌合肽的任何功能化学或重组等价物，其特征在于(在一最优选实施案中)其至少有一个来自GAS的M蛋白的B细胞表位且其中与B细胞表位反应的抗体与人心肌组织的反应性是最低程度的。术语“类似物”在本文中也包括任何上述的肽的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合肽，包括插入第二个氨基酸序列内的含一个构象表位的第一个氨基酸序列，其中所述的第一个肽及第二个氨基酸序列衍生自具有相似天然构象的肽，多肽或蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡安安东库珀，温迪安雷尔夫，迈克尔弗朗西斯古德，艾伦詹姆斯索尔，
申请(专利权)人：昆士兰医学研究所，联邦科学技术研究组织，墨尔本大学，沃尔特和伊利莎豪医学研究所，生物技术澳大利亚有限公司，CSL有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]