基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该引物针对大肠杆菌和志贺菌共同的一段特异序列(如SEQ ID NO.3所示)或其同源性达96％以上的同源序列设计合成，具体如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术中检测方法以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增产物与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达96％以上的判定为大肠杆菌、志贺菌阳性。该检测方法操作简单，敏感性和特异性高，与大肠杆菌、志贺菌的种属结果一致，检测费用低，具有良好的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒以及大肠杆菌、志贺菌检测方法，属于分子生物学

技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli)是临床上最常见的致病菌之一，也是近年来食品卫生和流行病学领域的重要研究对象。由于该菌经常出现在粪便污染的地方，因此被作为水源和食品粪便污染的指示菌。虽然大多数的大肠杆菌是人和动物的肠道兼性厌氧寄居菌群，在正常情况下不具有致病能力，但是某些特殊血清型的大肠杆菌具有致病性。这些致病性菌一般携带有特定的毒力基因，可以编码相应的毒性物质，引起腹泻、尿路感染、败血症和脑膜炎等病症，使寄主的健康遭受威胁(GaoQ,WangX,XuH,XuY,LingJ,ZhangD,GaoS.&LiuX.(2012).RolesofironacquisitionsystemsinvirulenceofextraintestinalpathogenicEscherichiacoli:salmochelinandaerobactincontributemoretovirulencethanhemeinachickeninfectionmodel.BMCMicrobiol12:143.)。严重的甚至引起血性腹泻和溶血性尿毒综合征等(GenotypicandphenotypicchangesintheemergenceofEscherichiacoliO157:H7.JInfectDis177:1750-3；Cheung,M.K.,Li,L.,Nong,W.&Kwan,H.S.(2011).2011GermanEscherichiacoliO104:H4outbreak:whole-genomephylogenywithoutalignment.BMCResNotes4:533.)。志贺菌是引起夏、秋季细菌性痢疾的主要病原体，传染性极强，20～100个CFU便能引起感染(封会茹,曲梅,耿荣,秦萌,余红,尉秀霞,赵伟,邢洪光,杨军勇,董晓根,赵建忠.2010-2012年北京市丰台区感染性腹泻病原菌分布及耐药性分析[J].疾病监测,2013,02:96-100.)。该病主要在发展中国家流行，在我国属于常见病，发病率位于我国传染病发病率的前三位(WangY,SongC,DuanG,etal.TranspositionofISEcp1modulatesblaCTX-M-55-mediatedShigellaflexneriresistancetocefalothin[J].IntJAntimicrobAgents,2013,42(6):507-512.)。目前，大肠杆菌和志贺菌的检测方法主要有常规检测法和分子生物学检测法，常规检测法又包括形态学鉴定和生化试验鉴定，其中形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要意义，但是该方法也存在一些缺点，比如重现率低，辨识能力低，相似的表型特征无法等同于相似或者关系密切的基因型等。所以对于那些通过表型特征难以区别的菌种，常规的检测方法就不能准确鉴定到种，并且该方法操作繁琐，实验周期长(邓梅葵,孙迎,韩雯晴.细菌鉴定方法[J].生物医学工程学进展,2014(02):84-88)。分子生物学检测法包括DNA(G+C)mol％、核酸杂交、16SrRNA序列分析、MLST(多位点序列分型，MultiLocusSequenceTyping)、全基因组测序以及核酸指纹图谱等(-SánchezB,Priego-CapoteF,deCastroML.MetabolomicsanalysisI.Selectionofbiologicalsamplesandpracticalaspectsprecedingsamplepreparation[J].TrACTrendsinAnalyticalChemistry,2010,29(2):111-119.)，具有快速、简便等特点，且能从本质上阐明细菌间的亲缘关系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物。同时，本专利技术还提供一种包含上述引物的检测试剂盒。最后，本专利技术再提供一种基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：大肠杆菌(种系B2除外，下同)和志贺菌检测引物，根据特异序列或者与该序列同源性达96％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQIDNO.3所示，同源序列如SEQIDNO.4所示。引物设计遵循本领域通用准则，采用常规引物设计软件完成。具体的，大肠杆菌和志贺菌检测引物如下所示：上游引物：5'-GTTATCAGCAACGCGCAAAA-3'；下游引物：5'-ACTGGATGCGATGATGGATA-3'。基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测试剂盒，包含以下引物：上游引物：5'-GTTATCAGCAACGCGCAAAA-3'；下游引物：5'-ACTGGATGCGATGATGGATA-3'。所述试剂盒还可以包括：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)、灭菌超纯水、阳性对照(大肠杆菌、志贺菌全基因组DNA)、10×PCR菌落增强剂以及DNAMarkerDL2000等。基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测方法，包括以下步骤：1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；2)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQIDNO.3(252bp)所示序列相同或同源性达96％以上的判定为细菌阳性；步骤1)中引物如下所示：上游引物：5'-GTTATCAGCAACGCGCAAAA-3'；下游引物：5'-ACTGGATGCGATGATGGATA-3'。步骤1)中待测样本基因组DNA可采用煮沸法或DNA提取试剂盒提取。步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，10～20ng/μL待测样本基因组DNA2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。或者，PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL。步骤1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min。步骤1)中阳性对照为大肠杆菌和/或志贺菌。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对CRISPRdatabase数据库中大肠杆菌和志贺菌全基因组测序结果进行分析以及对实验室保存的大肠杆菌和志贺菌检测发现，其具有一段共同的特异序列。针对该特异序本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物，其特征在于：该引物根据特异序列或者与该序列同源性达96％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测引物，其特征在于：该引物根据特异序列或者与该序列同源性达96％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述同源序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1或2所述的检测引物，其特征在于：该引物如下所示：上游引物：5'-GTTATCAGCAACGCGCAAAA-3'；下游引物：5'-ACTGGATGCGATGATGGATA-3'。4.基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含以下引物：上游引物：5'-GTTATCAGCAACGCGCAAAA-3'；下游引物：5'-ACTGGATGCGATGATGGATA-3'。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含2×TaqPCRMasterMix、阳性对照及10×PCR菌落增强剂。6.基于特异序列的大肠杆菌和志贺菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带...

【专利技术属性】
技术研发人员：段广才，梁文娟，陈帅印，张荣光，杨海燕，张卫东，范清堂，郗园林，
申请(专利权)人：郑州大学，新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41