用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，该基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别，利用该基因序列获取的SCAR分子标记引物，可快速简单判断瘿椒树雄性及两性性别。本发明专利技术提供的鉴定瘿椒树性别的SCAR标记引物，包括正向引物TS‑SCAR‑F和反向引物TS‑SCAR‑R，具体序列为：TS‑SCAR‑F：5＇‑ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA‑3＇，TS‑SCAR‑R：5＇‑CCAAATCCTTCAACAATATACCTG‑3＇。本发明专利技术将获得的雄性特异性的SRAP分子标记成功转化为可以100％对瘿椒树不同性别进行鉴定的稳定，准确，简单的SCAR标记。应用本发明专利技术所提供的SCAR引物组合可以对人工栽培及不同地区野生居群瘿椒树性别进行准确鉴定，应用范围广泛。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用
本专利技术属于分子生物学DNA分子标记检测
，具体涉及到利用SCAR快速鉴定瘿椒树性别的方法。
技术介绍
瘿椒树(TapisciasinensisOliver.),也称银鹊树，为雄全异株繁育系统，雄全异株(Androdioecy)繁育系统是被子植物中最为罕见的一类，所以其又是研究被子植物繁育系统演化及植物进化生活史方面的重要材料。确定瘿椒树早期的性别有助于研究雄全异株植物性别决定的遗传原理，有助于理解植物繁育系统的进化与维持。另外，不同性别的瘿椒树具有不同的经济价值，因此在实际应用中，根据目的的不同可选择合适的性别比例进行栽培。SRAP(SequenceRelatedAmplifiedPolymorphism，相关序列扩增多态性)标记是美国加州大学Li与Quiros于2001年在芸薹属植物中开发出来，一种基于PCR的新型分子标记技术。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段等特点。SRAP分子标记电泳结果分辨率高，稳定性好，易于测序，被广泛使用在遗传多样性分析等分子生物学领域，但SRAP分子标记应用于植物性别鉴别研究很少。SCAR(SequenceCharacteredAmplifiedRegion，序列特征化扩增区域)标记是1993年在RAPD等分子标记技术的基础上发展起来的。在获得一个与目标性状连锁的SRAP特异扩增条带后，进行条带回收测序，重新设计一对特异性的引物，并利用此特异性引物进行基因组PCR，从而将SRAP标记转化为更加直观的通过“有和无”条带判别的稳定，简便，重复性好的固定标记SCAR标记。获得与瘿椒树性别决定基因紧密连锁的SCAR分子标记，目前未见有报道。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用SCAR分子标记快速进行瘿椒树性别鉴定的方法，从而解决现有技术中无法准确快速进行瘿椒树早期性别鉴定的问题。为解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案来实现：一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列：ATTTCGCTAGGGTTTATAGCTTCTTACATCCTCTTCAGTCTTCTCAGTACCTCCCTTCCTATATAATCTTCATAGCCGCATAGCAAACCCTGGCTAGGGCTTCTTCTAATTTTCTCCGGTACTTTCTCTGTACTTTTCTCTGCATCTACCACTTTCAATATGATTTCTCTTTCCATTTTTTCATTTTGATCTGTTGATTTCAATTTTTTAGCTATGCATTTCTCTGTTTGTTTCGCGGGAAAACACTGAAAGTGAAAAAGAAAGAAAATTTTGGATCTCGAACTGATTCTGAGTGCCGATAGTATAAGACATTCCTTGTTTTAGTTATCCTTTTTATAGTAAATGTTCTAACTTTCAGTGATTGGTTTTTTTGATTTAGATCAGGTATATTGTTGAAGGATTTGGGTGTTATTGAATGTGTGTTTTGATGTATTG所述基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别。一种利用所述基因序列获取的SCAR标记引物，包括正向引物TS-SCAR-F和反向引物TS-SCAR-R，具体序列为：TS-SCAR-F：5＇-ATCTTCATAGCCGCATAGCAAA-3＇；TS-SCAR-R：5＇-CCAAATCCTTCAACAATATACCTG-3＇。其中，TS为瘿椒树拉丁名Tapisciasinensis首字母的缩写，F为正向引物，R为反向引物。所述应用包括，建立SCAR-PCR标记体系，利用正向引物TS-SCAR-F和反向引物TS-SCAR-R，通过SCAR-PCR产物的检测鉴定瘿椒树的雄性及两性性别。所述SCAR-PCR标记体系中的SCAR-PCR扩增体系包括：所述DNA模板为瘿椒树叶片的基因组DNA。所述SCAR-PCR产物的检测采用1％琼脂糖凝胶检测，以在分子量340bp位置处是否出现DNA条带来鉴别瘿椒树雄性和两性性别。若在分子量为340bp位置处出现DNA条带，为瘿椒树雄性植株的标志。如果在分子量为340bp位置处未出现DNA条带，为瘿椒树两性植株的标志。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术获得了一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，并最终将该基因序列用于设计出SCAR标记引物，可以进行简单快速的鉴别。(2)本专利技术将获得的雄性特异性的SRAP分子标记成功转化为可以100％对瘿椒树不同性别稳定，准确鉴定的简单的SCAR标记。(3)应用本专利技术所提供的SCAR引物组合可以对人工栽培及不同地区野生居群瘿椒树性别进行准确鉴定，应用范围广泛。(4)SCAR-PCR结束后利用琼脂糖凝胶肉眼就可以完成鉴定，大大节约了时间成本，实验室操作只需要2小时左右即可鉴定完成。(5)SRAP标记序列为与瘿椒树性别决定基因紧密连锁的分子标记，这个标记的获得对于后续性别决定基因的定位及雄全异株植物形成的分子机制研究具有重要理论意义。附图说明图1是利用TS-F2和TS-R6结合进行SRAP-PCR产生一条只在雄性中出现的特异性条带的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对校园12棵人工栽培已知性别的植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。图3是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对野外六个不同居群已知性别的植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。图4是利用TS-SCAR-F，TS-SCAR-R结合进行SCAR-PCR对校园14棵未知性别的小苗植株进行引物准确性验证的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术的保护范围。本专利技术图2，图3，图4中M为DL2000Marker(TAKARA),表示雄性植株，表示两性植株，图2中1-12代表12课已知性别的植株。图3中1和2分别代表在不同居群取雄性植株两棵，两性植株两棵进行准确性验证。图4中1-14代表未知性别的14棵小苗植株进行准确性验证。图1-4中大写字母均为不同采样地的汉语首字母大写：XY校园，NS宁陕，SN神农，YS永顺，YL炎陵，XF息烽，YN云南。实施例1本实施例提供一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，该基因序列的获取方法为：1、采用TIANGEN的PlantGenomicDNAKit对采集自七个地区(如表1所示)的瘿椒树雄性及两性植株进行基因组DNA提取。具体步骤为：(1)取硅胶干燥保存的植物叶片约30mg，加入液氮充分碾磨；(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，其特征在于，所述基因序列为SEQ ID No.3所示核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定瘿椒树性别的基因序列，其特征在于，所述基因序列为SEQIDNo.3所示核苷酸序列。2.权利要求1所述基因序列用于鉴定瘿椒树的雄性及两性性别的应用。3.一种利用权利要求1所述基因序列获取的SCAR标记引物，其特征在于，所述SCAR标记引物包括SEQIDNo.1所示正向引物TS-SCAR-F和SEQIDNo.2所示反向引物TS-SCAR-R。4.如权利要求2所述应用，其特征在于，建立SCAR-PCR标记体系，...

【专利技术属性】
技术研发人员：任小龙，刘文哲，彭春喜，王玲丽，辛桂亮，杜晓敏，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61