本发明专利技术属于生物基因工程技术领域，具体为一种甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID No：1；2)将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的且对植物种子含油量具有调控作用的蛋白质。本发明专利技术还包括含有本发明专利技术基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。该甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白的编码基因的表达改变能改变甘蓝型油菜种子中含油量。本发明专利技术为通过分子标记育种或基因工程来提高油菜籽含油量提供了一种新的途径。
Low molecular weight cysteine rich protein of Brassica napus and coding gene thereof
The invention belongs to the technical field of biological gene engineering, in particular to a low molecular weight cysteine rich protein of Brassica napus and a coding gene thereof and an application thereof. This protein is one of the following amino acid sequence: 1) in the sequence table SEQ ID No:1; 2) the amino acid sequence in the sequence of SEQ ID No:1 after one to five amino acid substitution and deletion and / or add formed and on plant seeds the oil content of regulatory protein. The invention also comprises recombinant expression vectors comprising the gene of the invention, transgenic cell lines and engineering bacteria, and primer pairs for amplifying any fragment of the gene. The expression of a low molecular weight cysteine rich protein gene in Brassica napus could change the oil content in Brassica napus seeds. The present invention provides a new approach for improving oil content of Rapeseed by molecular marker breeding or genetic engineering.
【技术实现步骤摘要】
一种甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白及其编码基因
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种与油菜遗传学调控相关的低分子量富含半胱氨酸蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
油菜是重要的经济作物。来自油菜的菜籽油是人类最主要的食用油来源之一，是我国粮油安全保障的重要一环，为我国重要的战略物质之一。作为食用油，菜籽油含有人类所需的多种脂肪酸，如营养价值很高的油酸与亚油酸两者含量高达90％以上，且菜籽油在人体中的消化率平均能达99％，为所有植物油中最高者。菜籽油中还含有多种脂溶性维生素，如维生素A、维生素D和维生素E，是人体脂溶性维生素的重要来源。除了作为食用油，菜籽油还是生物柴油的理想原料。人们对油菜籽油脂合成与积累机制有一定的了解，并运用这些知识在油菜育种与油菜基因工程方面取得了很大的成绩，比如在食用油方面选育出了低芥酸、低硫苷、低亚麻酸油菜品种，通过基因工程培育出了营养价值很高的高油酸品系；在工业用油方面培育出了高月桂酸与高芥酸油菜的培育；大规模生产的油菜籽含油量达到了42％左右。到目前为止尽管在油菜含油量与菜油品质方面取得了很大的成绩，但是油菜生产中还是会遇到一些新问题，比如相同的品种在不同的生态条件下栽培，种子含油量和产油量会发生改变，导致品种的适应性受限；在相同地区栽培，不同的品种对气候条件反应不一致，有的产油量与品质波动很大，有的影响较小；这些现象说明油菜种子中油脂的合成与积累过程中还有很多我们未知分子作用机制，对这些认识上的缺陷，阻碍了人们进一步提高油菜油脂产量与品质的努力。为了满足社会发展对菜籽油的消费需求的不断增加，必须对参与油菜油脂合成与积累的基因类型进行深入研究。
技术实现思路
低分子量富含半胱氨酸蛋白(low-molecular-weightcysteine-richprotein)基因在植物中是一个非常大的基因家族，在这个基因家族中，功能已知的基因是极少数，目前仅仅知道这个家族中的部分基因产物与抗病原菌相关，所以又命名为抗微生物肽；另一些已知的作用是参与植物花粉与柱头识别。其他大部分基因功能未知。我们在对油菜油脂合成与积累的分子机制进行深入研究的过程中，从甘蓝型油菜中发现一种编码低分子量富含半胱氨酸蛋白的功能未知基因Bna78。本专利技术通过基因工程的方法，首次发现低分子量富含半胱氨酸蛋白Bna78及其编码基因，该基因可用于提高甘蓝型油菜种子中的含油量。本专利技术的目的是提供一种来源于甘蓝型油菜的低分子量富含半胱氨酸蛋白及其编码基因与应用。本专利技术提供一种甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白，所述蛋白来源于甘蓝型油菜，其名称为Bna78，所述蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列；2)将SEQIDNo:1所示的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。序列表中的SEQIDNo:1由78个氨基酸残基组成。本专利技术还提供一种所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白的编码基因。在一种具体的实施方式中，所述基因是下述核苷酸序列之一：1)如SEQIDNo:2所示的核苷酸序列；2)编码SEQIDNo:1所示氨基酸序列的DNA序列；3)与SEQIDNo:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且与SEQIDNo:2编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与SEQIDNo:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo:2由237个碱基组成，其编码框为自5’端第1-237位碱基，编码具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸残基序列的蛋白质。本专利技术还提供一种如上所述甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的表达载体。本专利技术还提供一种如上所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的转基因细胞系。本专利技术还提供一种如上所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的工程菌。本专利技术还提供一种扩增如上所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因中任一片段的引物对。本专利技术还提供一种如上所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因在植物生长发育中的应用。在一种具体的实施方式中，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物，且所述基因用于调控植物种子含油量；优选所述植物为油菜。在一种具体的实施方式中，所述的植物为甘蓝型油菜。在一种具体的实施方式中，将所述甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的沉默表达载体转化油菜，得到高含油量的油菜材料。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。本专利技术的油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的沉默表达转基因植株种子含油量提高。本专利技术为油菜含油量的提高提供了一个目标基因。本专利技术的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。附图说明图1油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白Bna78基因全长CDS(蛋白质编码区)的PCR扩增产物电泳结果。图2Bna78基因的过表达质粒构建的菌落PCR验证，结果与预期的片段大小一致。图3Bna78基因的过表达质粒构建酶切验证，结果与预期的片段大小一致。图4Bna78基因沉默质粒构建的片段PCR扩增产物电泳结果，结果与预期的片段大小一致。图5Bna78基因沉默质粒构建中干扰片段正向插入的PCR检测，结果与预期的片段大小一致。图6Bna78基因沉默质粒构建中干扰片段反向插入的PCR检测，结果与预期的片段大小一致。图7正反向干扰片段插入后，Bna78基因沉默质粒的限制性内切酶酶切验证，结果与预期的片段大小一致。图8转pFGC5941-Napin-Bna78CDS质粒的抗性苗PCR检测结果。图中M为100bpplusLadderDNA；1-10为抗性苗，其中2-8为过表达转基因植株；+为阳性对照；-为阴性对照；WT为空白对照。图9转pFGC5941-Napin-Bna78RNAi质粒的抗性苗PCR检测结果。图中M为100bpplusLadderDNA；1-8为抗性苗，其中3为过表达转基因植株；+为阳性对照；-为阴性对照；WT为空白对照。图10薄层层析分析检测种子含油量变化。1为Bna78基因过表达转基因植株种子；2为湘油15号对照；3为Bna78基因沉默转基因植株种子。图11气相色谱法分析种子含油量变化。1为Bna78基因沉默转基因植株种子；2为湘油15号对照；3为Bna78基因过表达转基因植株种子。具体实施方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海生工生物科技有限公司完成。序列表中的SEQIDNo.1为Bna78基因对应的氨基酸序列，SEQIDNo.2为Bna78基因的全长编码序列，最后的TGA三个碱基为其终止密码子，对应SEQIDNo.1蛋白质序列中的最后一点“.”。实施例1甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因Bna78全长CDS的获得与过表达载体的构建。一、Bna78基因全长CDS的获得分别从甘蓝型油菜“湘油15号”开花后生长20天(淀粉积累期)和35天(油脂积累期)的种子中分离mRNA，分别构建cDNA文库；以开花后35天的油菜种子cDNA文库为检测子(tester)、开花后20天的油菜种子cDNA文库本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白，其特征在于，所述蛋白来源于甘蓝型油菜，其名称为Bna78，所述蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；2)将SEQ ID No:1所示的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白，其特征在于，所述蛋白来源于甘蓝型油菜，其名称为Bna78，所述蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列；2)将SEQIDNo:1所示的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因是下述核苷酸序列之一：1)如SEQIDNo:2所示的核苷酸序列；2)编码SEQIDNo:1所示氨基酸序列的DNA序列；3)与SEQIDNo:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且与SEQIDNo:2编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与SEQIDN...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘春林，阮颖，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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