一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用，可有效解决透明质酸纳米囊泡的制备及实现在肿瘤基因治疗药物中的应用问题，技术方案是，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，本发明专利技术原料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，制得的透明质酸纳米囊泡形态规则，粒径范围100‑300nm，结构稳定，分布均匀，生物相容性好，毒性低，能够负载高分子质量核酸类抗肿瘤药物，高摄取并转染至肿瘤细胞，从而实现在肿瘤治疗药物中的应用。

Hyaluronic acid nano vesicle, preparation method and application thereof

The invention relates to a hyaluronic acid nano vesicle and preparation method and application thereof, which can effectively solve the problem of hyaluronic acid nano vesicle preparation and application in tumor gene therapy in the technical scheme is that the hyaluronic acid is the chemical bond grafting of long chain, and in the end grafted polyethylene the function of long chain imine, when interacting with nucleic acid, polyethylene imine via electrostatic interaction of nucleic acid for compression, hyaluronic acid completely surrounding polyethyleneimine / nucleic acid vesicles form structure, the invention has wide source of raw materials, simple preparation method, low cost, the prepared hyaluronic acid nano capsule bubble shape, particle size range of 100 300nm, stable structure, uniform distribution, good biocompatibility, low toxicity, can anti tumor drugs high molecular weight nucleic acid load, high uptake And then transfected into tumor cells, so as to achieve the application in the treatment of tumor drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别是一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用。
技术介绍
研究证明，人类很多种疾病都与基因的功能或结构改变密切相关，基因治疗已成为改善人类健康的新兴医学治疗手段。基因治疗的关键在于选择合适的基因载体，使治疗基因高效、快速的运送至目的细胞，并实现其生物学功能。基因载体主要分为病毒基因载体和非病毒基因载体（CurrentDrugDelivery,2004,1:165）。与病毒基因载体相比，非病毒基因载体具有低毒性、无免疫性、容易制备、以及适用于体内研究等优点，而被广泛应用。由于磷酸基团的存在，DNA、RNA等核酸分子通常带有负电荷，因此以核酸为主体的基因传递载体通常带有一定的正电荷。研究表明，适量的正电荷不仅有利于核酸的压缩和包载，而且能够与负电荷的细胞膜发生相互作用，提高细胞摄取率。比如，我们曾以高度正电荷的聚乙烯亚胺修饰昆布多糖，构建得到一种阳离子化基因传递载体，它可以负载治疗性核酸片段高效转染至乳腺癌细胞，并有效抑制肿瘤生长（BioconjugateChemistry,2016,27:66）。但是，阳离子化的基因传递载体也存在其难以克服的缺点：由于正电荷的作用与血浆蛋白快速结合，并很快被体内的网状内皮系统清除，因而在体内的半衰期很短，不利于治疗基因的递送（CellResearch,2015,25:237）。透明质酸（Hyaluronicacid,HA）是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体各部位，是构成细胞外基质和胞间质的主要成分，在维持细胞外基质结构及调节细胞内活动方面都起着重要的作用（CarbohydratePolymers,2007,10:1）。研究发现，HA不但具有良好的生物相容性、可降解性、高黏弹性及非免疫原性等物理化学和生物学性质，而且可以与肿瘤细胞表面过量表达的CD44受体结合，增强了肿瘤细胞结合和内化透明质酸的能力，对肿瘤血管的生成、肿瘤转移性及侵袭性等具有重要的调节作用。不仅如此，HA结构中存在多种活性基团，有利于作为抗肿瘤药物载体材料的修饰。因此，HA在肿瘤靶向给药系统中的应用受到越来越多的关注（ControlledRelease,2011,156:231），具有极大的发展潜力和独特优势。但是至今未见到有关透明质酸纳米囊泡及其作为基因传递载体的公开报道。
技术实现思路
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用，可有效解决透明质酸纳米囊泡的制备及实现在肿瘤基因治疗药物中的应用问题。本专利技术解决的技术方案是，一种透明质酸纳米囊泡，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，所述透明质酸的分子量为50-5000kD，聚乙烯亚胺的分子量为600-2000D，透明质酸与、功能长链和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：3-10：3-10；所述功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸。其制备方法包括以下步骤：（1）将120-170mg透明质酸加入到12-17mL的N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，加入50-250mg活化试剂，避光，氮气保护下室温搅拌反应3-5h，再加入220-270mg功能长链，室温搅拌反应40-55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；所述的活化试剂为N-羟基丁二酰亚胺、羰基二咪唑、马来酸酐、乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和三乙胺中的一种或两种；所述的功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸（2）将上述产物溶于15mL的超纯水后滴加1-5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡；或将上述产物溶于15mL的超纯水中加入50-250mg活化试剂活化4h后，再与400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。所述方法制备的透明质酸纳米囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用。本专利技术原料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，制得的透明质酸纳米囊泡形态规则，粒径范围100-300nm，结构稳定，分布均匀，生物相容性好，毒性低，能够负载高分子质量核酸类抗肿瘤药物，高摄取并转染至肿瘤细胞，从而实现在肿瘤治疗药物中的应用。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1本专利技术在具体实施中可由以下方法制得：将150mg透明质酸加入到15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂138mg乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mgN-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水后滴加1ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。实施例2本专利技术在具体实施中可由以下方法制得：将120mg透明质酸加入到12mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂30mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应3h，再加入220mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应40h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水中加入活化试剂30mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐活化4h后，加入400mg的聚乙烯亚胺反应36h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。实施例3本专利技术在具体实施中可由以下方法制得：将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂150mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mgN-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应5h，再加入270mg氨基末端长链酸，室温搅拌反应55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水中加入活化试剂150mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mgN-羟基丁二酰亚胺活化4h后，再与600mg的聚乙烯亚胺反应72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。实施例4本专利技术在具体实施中可由以下方法制得：将140mg透明质酸加入到14mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和50mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入240mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水后滴加5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入550mg的聚乙烯亚胺反应55h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透明质酸纳米囊泡，其特征在于，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，所述透明质酸的分子量为50‑5000 kD，聚乙烯亚胺的分子量为600‑2000 D，透明质酸与、功能长链和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：3‑10：3‑10；所述功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸。

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸纳米囊泡，其特征在于，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，所述透明质酸的分子量为50-5000kD，聚乙烯亚胺的分子量为600-2000D，透明质酸与、功能长链和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：3-10：3-10；所述功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸。2.权利要求1所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将120-170mg透明质酸加入到12-17mL的N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，加入50-250mg活化试剂，避光，氮气保护下室温搅拌反应3-5h，再加入220-270mg功能长链，室温搅拌反应40-55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；所述的活化试剂为N-羟基丁二酰亚胺、羰基二咪唑、马来酸酐、乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和三乙胺中的一种或两种；所述的功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸；（2）将上述产物溶于15mL的超纯水后滴加1-5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡；或将上述产物溶于15mL的超纯水中加入50-250mg活化试剂活化4h后，再与400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。3.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将150mg透明质酸加入到15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂138mg乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mgN-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水后滴加1ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。4.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将120mg透明质酸加入到12mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂30mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应3h，再加入220mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应40h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL的超纯水中加入活化试剂30mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐活化4h后，加入400mg的聚乙烯亚胺反应36h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。5.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂150mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：任雪玲，张振中，林静，张红岭，武园园，刘晓，张瑞，孟二娟，韩淼，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41