丙-谷二肽合成方法技术

涉及一种丙－谷二肽合成方法，Ｎ端保护的氨基酸与三苯基磷、六氯乙烷在有机溶剂中反应形成活泼酯；活泼酯与谷氨酰胺在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行，用无机酸酸化，然后脱去Ｎ端保护基团。其原料极为便宜，合成工艺简单，中间产物不需要分离和提纯处理，产物容易分离提纯；省去了有机碱、谷氨酰胺氨基酸接保护基团保护和脱除保护基团，简化了合成路线，节约了成本，缩短了时间，提高了产率，节省了溶剂和试剂，对环境友好；而且产物可直接分液得到，简化了生产设备，降低成本，有利环保；反应结束生成两个产物，丙－谷二肽和副产物三苯基氧磷，后者为不挥发的固体，容易回收，整个合成过程中所采用的试剂毒性均较小。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含氨基酸的二肽合成方法，尤其是一种丙—谷二肽合成方法。谷氨酰胺是人体中含量最多的氨基酸，谷氨酰胺在肌肉蛋白质和血浆蛋白质中含量约分别为75％和26％。谷氨酰胺具有重要的生理作用。谷氨酰胺是生物合成核酸的必需前体物质，是蛋白质合成与分解的调节物，是氨基氮从外周组织转动至内脏的携带者，是肾脏排泄氨的重要基质。谷氨酰胺是肠粘膜上皮细胞、肾小管细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的重要能量物质，在维持肠道机能，促进免疫功能，维持体内碱平衡及提高机体对应激的适应等方面都发挥着极其重要的作用。在临床上的严重感染、复合性骨折、创伤、大手术、大面积烧伤与恶性肿瘤后期等应急和高分解代谢状态下，谷氨酰胺的需要大大超过了机体合成谷氨酰胺的能力，使体内谷氨酰胺的含量降低，从而使核酸、蛋白质合成减少。若采用传统的全静脉营养液(TPN)，则可能导致肠粘膜萎缩，肠粘膜通透性升高和细菌易位，甚至导致败血症及多器官功能衰竭。大量的实验表明，补充GLN的TPN对许多疾病的预防和恢复有显著作用，若在TPN中加入一定量的谷氨酰胺，以提高血液和肌肉等组织中谷氨酰胺浓度，则对维持或恢复肠粘膜功能具有重要作用。给严重感染的病人输入补充GLN的TPN，明显保持正氮平衡和促进细胞GLN合成酶的表达，减轻肌细胞内GLN浓度和核糖体浓度的降低。近年来，因为谷氨酰胺重要的生理功能和药理作用，使其在肠外营养中的应用受到人们普遍的重视。如上所述，在各种创伤(包括意外伤、手术伤、及辐射伤)、感染等应激条件下，血中和细胞中的谷氨酰胺浓度降低，而补给现有的氨基酸制剂(不含GLN)，不能使其逆转；一些重要的细胞功能如蛋白质的合成、细胞的吞噬作用和淋巴细胞的增殖，都必须依赖充足的GLN。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下，生成有毒的焦谷氨酸和氨，所以商品氨基酸制剂中部不含有GLN。目前GLN的应用主要有以下途径(1)现配现用，把GLN晶体加到氨基酸溶液中，然后过滤除菌，在8h内输完。这一过程必须严格无菌操作且工作繁琐，费力，适用范围受到限制；(2)合成GLN衍生物，如乙酰谷酰胺。它容易合成，加热稳定，在体内可形成GLN，便是它的利用率较低，摄入量的40％被从尿中排泄掉；(3)应用GLN的二肽。目前，用于试验研究的二肽主要有两种甘氨酰谷氨酰胺(L-glynyl-L-glutamine，Gly-Gln)和丙—谷二肽(Ala-Gln)。动物和人体实验证明，在体内，这两种二肽很快被分为其组成氨基酸，半衰期很短，血液中只能检测到少量的二肽，仅有微量的二肽从尿中排出。说明GLN二肽可有效地利用而且不会在血积聚，避免了二肽可能产生的药理及生理性损害。有实验证明，健康人体长期静脉注射滴注Ala-Gln二肽没有任何副作用及不良反应，不影响正常的肾功能。用化学方法合成的Ala-Gln经纯化其溶解度是GLN单体的20倍，在储存和加热灭菌中也很稳定，而进入体内后即迅速分解成GLN而发挥作用，使GLN在TPN中的应用更加方便可行。丙—谷二肽合成方法有如下4种1、首先将GLN(谷氨酰胺)的氨基进行保护，形成Cbz-Gln；第二步，将Cbz-Gln的酰氨基保护形成Cbz-Gln(OC13H9)；第三步，将Cbz-Gln(OC13H9)的羧基保护形成Cbz-Gln(OC13H9)OMe；第四步，通氢气形成Gln(OC13H9)OMe；第五步，加入CBZ-ALA；第六步，对CBZ-ALA活化；第七步，CBZ-ALA和Gln(OC13H9)OMe结合成肽；第八步，皂化脱甲酯；第九步，酸化脱去全部保护，形成丙—谷二肽。(文献Yasutsugu Shimomishi，Studies onthe Synthesis of Peptides Containing Glutamine as the C-Terminal.Y.Bull.Chem.Soc.Jpn.1962，35，1966)该方法反应步骤太多，而且试剂昂贵，无实际应用价值。2、利用Z-Ala与HOSu在DCC作用下，于20～25℃反应5h，过滤去二环己基脲，然后与未保护的Gln于碳酸氢钠的水溶液中进行合成。产物在甲醇中还原氢化，脱去保护基，即可得到丙—谷二肽。(文献Katoh，T.Kurauchi，M.Eur.Pat311，057，12Apr.1989)该方法的试剂昂贵，而且DCC反应后的产物难以除去，而且生产过程复杂。3、利用COCl2与Ala反应生成混酐，然后与Gln在水中反应，pH保持在10.2。最后在酸溶液中脱去保护，即可得到丙—谷二肽。(文献Frerst，P.Pfaendetr，P.Ger.Offen.DE3206，784.OlSep1983)此方法的反应步骤简单，但光气为剧毒气体，而且该反应难以反应完全，对人体危害较大。4、利用手性试剂氯代丙酸通过SOCl2活化，形成酰氯，然后与Gln在NaOH的水溶液中反应，pH保持在10。产物为氯代丙酰谷酰胺，再与液氨在一定的压力下反应，即可得到丙—谷二肽。(文献Takahiro Sano，Toru Sugaya，Process Research ang Development ofl-Alanyl-l-glutamine，a Component of Parenteral Nutrition.Oganic Process Researchand Development.2000，4，147-152)该反应的原料为手性试剂，极为昂贵，在合成酰氯步骤中，温度较高，副反应较多。该合成用于生产，成本太高。本专利技术的目的在于提供一种原料便宜、合成工艺简单、设备简单、成本低、产率高、有利于环保的丙—谷二肽合成方法。丙—谷二肽合成方法的步骤1)N端保护的氨基酸(I)10mmol，与三苯基磷(Ph3P)10～30mmol，最佳15～20mmol，六氯乙烷(C2Cl6)10～30mmol，最佳15～20mmol，在有机溶剂(II)中反应20min～3h，最佳1.5～2h，反应温度-5～30℃，最佳0～10℃，形成活泼酯；2)活泼酯与谷氨酰胺10～30mmol，最佳为15～20mmol，在有机溶剂(III)和无机碱水溶液(IV)的混合溶液中进行(III和IV的体积比值为0～4，最佳为0.5～2，)反应温度为-5～30℃，最佳为5～10℃，pH控制在8.5～13，最佳为9.5～10.5；3)用无机酸(V)酸化至pH≤3.0，最佳为2.0～3.0，然后脱去N端保护基团(VI)，可得到丙—谷二肽，产率为30％～65％。其中(I)，N端保护的氨基酸主要有N-(O，O-二异丙基)磷酰氨酸(DIPP-l-Ala)，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸(DEP-l-Ala)，N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸(DMP-l-Ala)，苄氧羰基丙氨酸(Z-l-Ala)，(对甲氧羰基)苄氧羰基丙氨酸(MZ-l-Ala)，叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-l-Ala)，2-(二连苯基)异丙氧羰基丙氨酸(Bpoc-l-Ala)，等；(II)有机溶剂主要有二氯甲烷，甲苯，四氢呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷，等；(III)有机溶剂主要有乙醇，乙酸乙酯，石油醚，环己烷，甲苯，二氯甲烷，等；(IV)无机碱主要有氢氧化钠，本文档来自技高网...

【技术保护点】
丙－谷二肽合成方法，其特征在于１）Ｎ端保护的氨基酸１０ｍｍｏｌ，与三苯基磷１０～３０ｍｍｏｌ，六氯乙烷１０～３０ｍｍｏｌ，在有机溶剂中反应２０ｍｉｎ～３ｈ，反应温度－５～３０℃，形成活泼酯； ２）活泼酯与谷氨酰胺１０～３０ｍｍｏｌ，在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行，有机溶剂和无机碱水溶液的体积比值为０～４，反应温度为－５～３０℃，ｐＨ控制在８．５～１３； ３）用无机酸酸化至ｐＨ≤３．０，然后脱去Ｎ端保护基团，可得到丙－谷二肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉芬，唐果，周宁，胡利明，陈勇，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]