含有牡蛎低分子活性肽的提取组合物与制备方法和应用技术

涉及一种首次从自然界分离提取的多肽和制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。牡蛎低分子活性肽其组份含有八种蛋白，分子量分别为４４ｋＤ、３９．８ｋＤ、３１．６ｋＤ、１０ｋＤ、７．９ｋＤ、６．３ｋＤ、５．３ｋＤ和５．０ｋＤ，其中５．３ｋＤ的蛋白可被阳离子交换柱琼脂糖凝胶ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ强烈吸附，是一种碱性蛋白。采用酸抽提和分子筛层析方法有效地对牡蛎进行抽得和分离提取，获得ＢＰＯ－Ｌ，既能使牡蛎细胞中的蛋白得到充分的抽提，又能使蛋白活性得到最大限度的保留。并且具有明确的抗肿瘤活性作用，能有效地干预癌细胞相关癌基因与抑癌基因表达，进而诱导癌细胞分化。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种首次从自然界分离提取的多肽和制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。(2)
技术介绍
海洋生物活性物质抗肿瘤研究是海洋生物活性物质开发与海洋药物研究的重要方面。自20世纪80年代以来，已相继从海藻、海绵、腔肠动物和软体动物中提取出一系列具有抗肿瘤作用的萜类、生物碱、大环聚酯、肽类、聚醚等化合物，显示从海洋生物中寻找抗癌新药有着广阔前景。牡蛎不仅是一种高营养价值的海产品，也是一种很有药用价值的海洋生物，其药用价值和保健功能不仅在中国药领域中得到推崇，近些年来同样受到国内外一此学者的重视。国内外报道了牡蛎提取物具有抗肿瘤作用，如对癌细胞的放射增敏、清除氧自由基以及对动物机体的免疫调节作用等。王颖等公开了一种牡蛎提取物抗肿瘤作用的实验研究(中国海洋药物，1997，16(1)18-22)；曹弃元等公开了一种牡蛎提取物体外放射增敏作用(中国海洋药物，1993，12(2)11-13，29)。(3)
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种首次从牡蛎中分离提取的牡蛎低分子活性肽组分(The BioactivePeptides of Oyster in low molecular weight group，BPO-L)。本专利技术的另一目的是提供一种从牡蛎(Saccostrea cucullata)中分离提取BPO-L的方法。本专利技术的另一目的是BPO-L在制备抗癌药物中的应用。本专利技术所说的BPO-L的组份含有八种蛋白，分子量分别为44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD。其中5.3kD的蛋白可被阳离子交换柱琼脂糖凝胶CM-Sepharose CL-6B强烈吸附，是一种碱性蛋白。本专利技术所说的BPO-L的制备方法是l、将牡蛎匀浆，收集匀浆液；2、对牡蛎匀浆液酸抽提，收集上清液；3、对牡蛎匀浆上清液进行分子筛层析，收集含有牡蛎低分子活性肽组份；4、对含有牡蛎低分子活性肽组份进行脱盐，收集BPO-L；5、将获得的BPO-L进行离子交换柱层析。在牡蛎匀浆时，可加入Tris-HCl缓冲液，其含量为新鲜牡蛎与Tris-HCl缓冲液的体积比为1∶1。对牡蛎匀浆液采用酸抽提时，可用20mmol/L HCl反复抽提，收集所有的上清液置冷冻干燥机后即为牡蛎酸提物。所说的分子筛层析可将牡蛎酸提物溶解于洗脱液中，再将牡蛎酸提物溶解液加到层析柱的葡聚糖凝胶Sephadex G-50胶面上洗脱。所说的脱盐可将含有Cl-离子的BPO-L溶解于加样缓冲液里，再将其加到层析柱的葡聚糖凝胶Sephadex G-25上洗脱。所说的离子交换柱层析可将BPO-L溶解于NaAc-HAc缓冲液中，再加到离子交换柱的琼脂糖凝胶CM-SepharoseCL-6B平面上洗脱。所说的BPO-L可作为制备抗癌药物的活性组份。本专利技术采用酸抽提和分子筛层析方法有效地对牡蛎进行抽得和分离提取，获得BPO-L，既能使牡蛎细胞中的蛋白得到充分的抽提，又能使蛋白活性得到最大限度的保留。并且具有明确的抗肿瘤活性作用，能有效地干预癌细胞相关癌基因与抑癌基因表达，进而诱导癌细胞分化。(4)附图说明图1为小分子肽类SDS-PAGE电泳图。图2为BPO-L分离纯化操作流程图。图3为凝胶柱Sephadex G-50洗脱曲线。图4为凝胶柱Sephadex G-25脱盐洗脱曲线。图5为离子交换柱CM-SepharoseCL-6B洗脱曲线。图6为BPO-L对人肺腺癌A549细胞生长的影响。图7为BPO-L对人肺腺癌A549细胞分裂指数的影响。图8为BPO-L对人肺腺癌A549细胞细胞周期的影响。图9为HE染色观察结果图版。图10为A549细胞透射电子显微镜观察图版。图11为0.1mg/ml BPO-L处理后的透射电子显微镜观察图版。图12为BPO-L对A549细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响图版。(5) 具体实施例方式BPO-L是鲜活牡蛎经匀浆，离心再经酸抽提和Sephadex G-50凝胶柱层析后，从小分子洗脱峰中分离所得到的一组低分子活性物质。该物质有八种蛋白，分子量分别为44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD。其中5.3kD的蛋白可被阳离子交换柱CM-SepharoseCL-6B强烈吸附，是一种碱性蛋白。图1为小分子肽类SDS-PAGE电泳图，其中1.标准蛋白(由上往下分别为溶菌酶14,300Da，β-乳球蛋白18,400，碳酸酐酶29,000Da，卵清蛋白43,000，牛血清白蛋白68,000Da磷酸化酶B97,400；肌球蛋白(重链)200,000)；2.牡蛎酸提物；3.牡蛎低分子活性物质；4阳离子交换柱柱层析峰。本专利技术所说的BPO-L制备方法参见图2，其步骤如下1 牡蛎酸提物的制备将新鲜的牡蛎按1∶1(v/v)的比例和Tris-HCl缓冲液混匀，置于组织匀浆机匀浆。收集匀浆液，高速冷冻离心机，4℃离心，弃上清。将收集的沉淀重新悬浮于Tris-HCl缓冲液中，重复匀浆，反复共3次。最后收集的细胞碎片悬浮于20mMHCl中，置于组织匀浆机充分匀浆。收集匀浆液，4℃离心并收集上清。沉淀重新用20mmol/L HCl反复抽提。收集所有的上清液置冷冻干燥机干燥后即为牡蛎酸提物。2 牡蛎低分子活性肽的分离提取与脱盐将Sephadex G-50凝胶溶于双蒸水中并置于沸水浴中，使其充分溶胀，加入凝胶缓冲液稀释到适当的浓度。然后将Sephadex G-50胶缓慢的灌入已经垂直装好的层析柱中(100×φ3.0cm)中使其自然沉降并保留适当的柱高，平衡缓冲液平衡过夜。将冷冻干燥的牡蛎酸提物溶解于洗脱液中，通过长嘴吸管将酸提物溶解液缓慢的加到胶面上，40mL/h流速洗脱，核酸蛋白检测仪280nm检测，XWT-S型小型台式记录仪记录，人工收集含有牡蛎低分子活性组分的峰2冷冻干燥。参见图3(葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50洗脱曲线)。再称取Sephadex G-25凝胶，沸水溶胀。Tris-HCl缓冲液稀释，缓慢灌入垂直装好的层析柱(20×φ2.0cm)中，Tris-HCl缓冲液平衡过夜。将含有Cl-离子的牡蛎低分子活性组分溶解于加样缓冲液里，100mL/h流速洗脱，核酸蛋白检测仪280nm处检测、记录(参见图4)，人工收集牡蛎低分子活性组分(即为牡蛎低分子活性肽，BPO-L)，冷冻干燥后-20℃保存备用。3 牡蛎低分子活性肽离子交换柱层析把CM-SepharoseCL-6B凝胶沸水浴充分溶胀，NaAc-HAc缓冲液稀释后缓慢的灌入垂直装好的玻璃层析柱(20×φ1.5cm)中，自然沉降，NaAc-HAc缓冲液平衡过夜。将SephadexG-25峰3的冻干品溶解于NaAc-HAc缓冲液中，1mol/L NaOH调节pH至6.0后，加到柱平面上，缓冲液以80mL/h流速洗脱，核酸蛋白检测仪280nm处检测，人工收集含有牡蛎低分子活性肽的峰3(参见图5，其中↓处表示更换强离子洗脱液)，待基线平衡后，改用NaAc-HAc缓冲液(pH6.0含1.5mol/L NaCl)洗脱。结果发现BPO-L的大部分蛋白组分由于不含有碱性氨基酸或含有碱性氨基酸很少而和离子交换柱结合较弱，因而很容易被洗脱下来，只有少部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
牡蛎低分子活性肽，其组份含有八种蛋白，分子量分别为４４ｋＤ、３９．８ｋＤ、３１．６ｋＤ、１０ｋＤ、７．９ｋＤ、６．３ｋＤ、５．３ｋＤ和５．０ｋＤ，其中５．３ｋＤ的蛋白可被阳离子交换柱琼脂糖凝胶ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ强烈吸附，是一种碱性蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李祺福，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]