Heterocarpine,人GHRH结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及人ＧＨＲＨ（人生长激素释放激素）结合蛋白。上述得自植物Ｐｉｌｏｃａｒｐｕｓ　Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ的蛋白可用于制备抗ＧＨＲＨ作用和治疗增生性疾病（特别是癌症）、肢端肥大症或糖尿病相关肾病和视网膜病的药剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,人GHRH结合蛋白的制作方法
本专利技术涉及人GHRH(人生长激素释放激素)结合蛋白。生长激素(“GH”)是含有191个氨基酸的蛋白，它刺激许多生长因子如类胰岛素生长因子I(IGF-1)的生成和大量组织如骨骼、结缔组织、肌肉和肠的生长。GH也具有生理活性，能促进核酸、蛋白质的合成与脂肪的分解，减少尿的分泌(Frohman L.A.& Kineman，R.D.，Handbook ofPhysiology，Hormonal Control of Growth，Kostyo，J.L.& Goodman，H.M.编著(Oxford Univ.Press，New York，1999)，p.189-221)。GH的合成受到下丘脑分泌因子的正或负调节。控制GH生成的主要因子是“生长激素释放激素”，它是人体中一种含44个氨基酸的肽。GH和GHRH和很多疾病相关。其中特别要提的是癌症(特别是前列腺癌或肺癌)，肢端肥大症，糖尿病相关视网膜病和肾病；对于这些疾病，需要用GHRH拮抗剂治疗。由于它潜在的和这么多疾病相关，工业上一直进行GHRH拮抗剂的研究。申请人从植物中分离出了一个新的蛋白，它能和人GHRH结合。因此，本专利技术的第一个主题就是从植物Pilocarpus heterophyllus中提取的一种蛋白，其特征是它的分子量约为90.9kDa，且包含SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的肽片段。上述蛋白可以呈糖基化或非糖基化的形式。为了简化下面的公开，此后将该蛋白称为“heterocarpine“。上述SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的序列如下SFQ.ID.NO.1KLIGARYFDKSEQ.ID.NO.2YGEDIIVGVIDSGVSEQ.ID.NO.3PESESY上面描述肽所用的术语(本申请剩下部分也会用到)为“IUPAC-IUB生物化学术语委员会”所规定，根据标准表示方式，N-端氨基酸(氨基)位于左边，C-端氨基酸(羧基)位于右边。术语“天然氨基酸”是指在自然界中发现的L-型氨基酸Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Lys，Arg，Asp，Asn，Glu，Gln，Cys，Met，Phe，Tyr，Pro，Trp和His。如果一种蛋白分离自原来的环境，则其被称为“分离的”，特别是当它从与其并存于天然系统中的生物物质中分离出来时。优选本专利技术涉及非糖基化形式的heterocarpine。根据本专利技术优选方案，heterocarpine来自体外培养的植物PilocarpusHeterophyllus的细胞提取物。此外，本专利技术的另一个主题是一种单克隆抗体，或者是该单克隆抗体的抗原结合片段，它能专一性的和heterocarpine结合。具有和人GHRH结合的特性。在体外，heterocarpine能和人RHRH结合而阻止了人GHRH和其受体结合后引起的环AMP的合成。用大鼠进行的体内实验发现，heterocarpine/人GHRH复合物在血管腔隙(blood compartment)中以摩尔与摩尔的比例形成，它以剂量依赖型方式抑制GH的合成，其中GH的合成由10μg人GHRH诱导。具有和人GHRH结合的特性。本专利技术化合物的这些特点使其适合用于制药。因此，本专利技术的再一个主题是作为药剂的糖基化或非糖基化的heterocarpine。本专利技术也涉及药物组合物，它含有糖基化或非糖基化的heterocarpine作为活性成分，也包含一种或更多的制药学上可接受的赋形剂。另一个主题是糖基化或非糖基化heterocarpine的应用，用来制备抗GHRH影响的药剂以治疗增生性疾病(特别是癌症)、肢端肥大症或糖尿病相关视网膜病和肾病。对于癌症，heterocarpine特别适合制备药剂，用以治疗良性肿瘤和胰腺癌，下丘脑-垂体神经节细胞癌，支气管的、肠的和肝脏的癌，交感性肾上腺素肿瘤，嗜铬细胞瘤，垂体腺瘤和甲状腺癌。本专利技术也涉及作为药剂的单克隆抗体，或其能专一性的和heterocarpine结合的抗原结合片段。它也和药物组合物相关，该组合物含有作为活性成分的单克隆抗体或者能专一性的和抗原heterocarpine结合的片段，也包含一种或更多的制药学上可接受的赋形剂。该主题也涉及单克隆抗体或者能专一性的和抗原heterocarpine结合的片段的应用，用以治疗增生性疾病(特别是癌症)、肢端肥大症或糖尿病相关视网膜病和肾病。对于癌症，上述单克隆抗体或者上述专一性的和抗原heterocarpine结合的片段特别适于制药，用以治疗良性肿瘤和胰腺癌，下丘脑-垂体神经节细胞癌，支气管的、肠的和肝脏的癌，交感性肾上腺素肿瘤，嗜铬细胞瘤，垂体腺瘤和甲状腺癌。本专利技术也涉及使用heterocarpine作为赋形剂用于药物组合物中以控制GHRH的释放。本专利技术也涉及含有GHRH，heterocarpine和一种或多种制药学上可接受的赋形剂的药物组合物。最后，本专利技术其他主题是从植物Pilocarpus Heterophullus细胞中提取和分离heterocarpine的方法，优选上述细胞来自体外培养物。这些方法主要包括用水对植物Pilocarpus Heterophullus细胞的提取步骤，温度为0到50℃，优选4到25℃，上述提取步骤后为过滤步骤，以从PilocarpusHeterophullus细胞中分离出富含heterocarpine的滤出液。之后是一个或多个步骤以将heterocarpine从植物Pilocarpus Heterophullus提取液中其他组分中分离出来。根据第一个可选方案，这些提取和分离方法主要包括下面的连续步骤a)用水对植物Pilocarpus Heterophullus细胞的提取步骤，温度为0到50℃，优选4到25℃，上述提取步骤后为过滤步骤，以从Pilocarpus Heterophullus细胞中分离出富含heterocarpine的滤出液；b)抽提液中蛋白质的沉淀步骤，如加入硫酸铵后对沉淀物进行分离(通过过滤或优选通过离心)；c)将步骤b)中回收的沉淀物溶于水中；以及d)凝胶过滤层析步骤以将heterocarpine从含有其他组分的溶液中分离出来。根据另一个可选方案，这些提取和分离过程主要包括如下连续步骤a)用水对植物Pilocarpus Heterophullus细胞的提取步骤，温度为0到50℃，优选4到25℃，上述提取步骤后为过滤步骤，以从Pilocarpus Heterophullus细胞中分离出富含heterocarpine的滤出液；b)对a)中得到的溶液进行脱脂步骤，加入非氧化酸(如盐酸，硫酸或磷酸)使其酸化，调节pH优选2到4之间，用液-液萃取(优选为加入有机溶剂如二氯甲烷、庚烷、己烷或环己烷)；c)去除单宁步骤，让b)中得到的脱脂溶液和聚乙烯吡咯烷酮(或尼龙66)接触，之后用大孔树脂(优选为用聚苯乙烯基树脂如树脂DiaionHP-20)过滤；d)通过加入碱如氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾调节步骤c)所得滤液至碱性pH(优选pH在9到11之间)；e)用阴离子交换树脂进行的一个或多个过滤步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
从植物Ｐｉｌｏｃａｒｐｕｓ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｓ中提取的分离蛋白质，其特征是它的分子量约为９０．９ｋＤａ，并包含肽序列ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２和ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３；上述蛋白可以呈糖基化或非糖基化的形式。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E费兰迪斯，邓朋本，C索耶，C蒂瑞奥，
申请(专利权)人：科学研究和应用咨询公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]