一种裂解致病菌的肽及其用途制造技术

本发明专利技术提供了来自结核分枝杆菌噬菌体的新抗菌肽。该肽命名为结核分枝杆菌裂解肽ＭＢＬ－１。从分枝杆菌噬菌体纯化了ＭＢＬ－１。本发明专利技术提供了相关的氨基酸序列。纯化的ＭＢＬ－１能够裂解分枝杆菌。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学领域，涉及一种裂解致病菌，尤其是耐药性结核分枝杆菌的肽。该肽可以作为药物单独或者与适合药物的组分一起裂解致病菌，从而治疗致病菌感染。
技术介绍
结核病是严重危害人类健康的传染病，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来全球结核病疫情的回升引起了国际社会的高度重视。1993年和1998年，世界卫生组织两个就结核病问题发出全球预警。当前我国的结核病防治工作还面临严峻的挑战。我国仍然是全球结核病严重流行的国家，现有结核病人占全球的1/4，死亡人数多，疫情下降缓慢，危害严重。在结核病人中，有3/4是最具有生产能力的青壮年。重庆市为中国结核病的第二高发区。如果我们不及时采取有效措施，结核病蔓延将进一步加剧，已取得的结核病控制成果将付之东流，给家庭和国家造成更加严重的损失。对此，我们要有高度的认识，否则要付历史的责任。结核病防治的难点主要在于其致病菌-结核分枝杆菌独特的生物学性质以及对它的基础研究还很欠缺。表现为耐药性愈演愈烈，结核分枝杆菌几乎对所有的一线药物都产生了不同程度的耐药性，同时耐两种以上一线药物的耐多药菌株的出现频率也在上升。解决结核病问题的迅速有效措施是开发特异性的新药。噬菌体是细菌的病毒，能够特异性裂解宿主细菌。其特异性裂解细菌的酶可能是药物开发的理想先导分子。噬菌体在敏感菌株中的裂解循环末期，所有双链DNA噬菌体都产生一种降解细菌细胞壁的裂解系统，该系统包括holin和至少一种肽聚糖水解酶(peptidoglycanhydrolase)，也称为裂解素(lysin)。裂解素可以是1.endo-beta-N-乙酰葡萄糖胺酶；2.N-乙酰胞壁酸酶N-acetylmuramidases(溶菌酶lysozymes)，作用在糖成分上；3.内肽酶(endopeptidases)，剪切肽键；4.N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，水解连接糖和肽的酰胺键。Holin在噬菌体感染晚期表达，在细胞膜上打孔，允许裂解素接近细胞壁肽聚糖，最终导致子代噬菌体释放。只有裂解素，无需噬菌体也能够裂解敏感宿主菌，该现象称为“无噬菌体裂解”(lysis fromwithout)。人体嗜中性粒细胞产生一种克隆裂解肽，对结核分枝杆菌具有裂解活性，但为非特异性，对其他细菌也具有裂解活性。Staphylococcus simulans产生的内肽酶lysostaphin能够切除金黄色葡萄球菌肽聚糖的五甘氨酸交联(pentaglycine cross bridge)。Lysostaphin对耐万古霉素金黄色葡萄球菌引起的实验性动脉管心内膜炎有效。结核分枝杆菌具有裂解性噬菌体DS6A，D29。国外研究目前只从病毒学的角度进行，开发作为结核分枝杆菌分子遗传研究的工具，没有研究其药物开发价值。研究这些噬菌体的lysin，可能将找到治疗耐药结核病新的抗生素。参考文献1.谢建平 结核分枝杆菌的后基因组研究和新型疫苗 微生物学报，2001，4151-572.Nelson D，Loomis L，Fischetti VA.Prevention and elimination of upper respiratorycolonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme.PNAS，2001，984107-41123.Hatfull GH，Methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，NeilG.Stoker，Humana Press Inc，Totowa，NJ.145-174)技术方案与技术效果本专利技术的目的之一是分离结核分枝杆菌裂解性噬菌体的裂解活性成分，本专利技术的另一目的在于将分离到的裂解肽用于结核分枝杆菌等致病菌感染的治疗。本专利技术主要通过分离裂解包括结核分枝杆菌在内的分枝杆菌的噬菌体。大规模培养分离到的噬菌体，提取其裂解活性成分并鉴定其结构和相应功能。实施方式菌株和培养实验所用菌株Mycobacterium tuberculosis H37Ra(ATCC 25 177)由重庆市肺科医院检验科MTB检验室提供。快生型分枝杆菌为专利技术人分离并保存。细菌在Middlebrook7H10(Difco)添加OADC(0.5％BSA，0.2％glucose，0.06％oleic acid，140mMNaCl)的液体培养基中，37℃培养。在7H10固体培养基上连续稀释后观察CFU，测定细菌存活力和噬菌斑。分离噬菌体 采用环境土样，按照文methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，Neil G.Stoker，HumanaPress Inc，Totowa，NJ.145-174)分离裂解性噬菌体。采集环境土样，溶解于噬菌体缓冲液中，4℃过夜，5000g离心10min去除不可溶的碎片，上清液先后经0.45μm和0.2μm滤膜灭菌，确定噬菌体的滴度；将100ml上清液与2L生长到对数早期OD＝0.2的结核分枝杆菌混合，培养细菌到对数晚期OD＝0.6。大规模制备噬菌体蛋白培养细菌，稀释的噬菌体点双层平板，过夜培养，加入噬菌体缓冲液，吸取溶解噬菌体的缓冲液，离心去除碎片，1M氯化钠沉淀噬菌体，3500g离心5min，氯化铯密度梯度离心收集蛋白质组分。分离裂解素分离离心的各组分，逐个检测对分枝杆菌的裂解活性。纯化具有裂解活性的组分，进行氨基酸序列测定。裂解素作用特异性的检测分别以大肠杆菌、啤酒酵母、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌为模式，检测裂解素对其他细菌的裂解效果。结果分离到序列为EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X为任意氨基酸的肽对结核分枝杆菌和快生型分枝杆菌具有裂解活性，其对结核分枝杆菌的MIC值为100ug/ml。权利要求1.一种分离自分枝杆菌噬菌体的裂解肽，包括下列氨基酸EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X为任意氨基酸。2.权利要求1所述的肽，肽含有至少一个修饰过的氨基酸。3.权利要求2所述的肽，其中修饰的氨基酸在羧基末端。4.权利要求1所述的肽，该肽对包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒具有裂解活性。5.权利要求4所述的肽，该肽对结核分枝杆菌具有裂解活性。6.权利要求4所述的肽，该肽对耐药结核分枝杆菌具有裂解活性。7.权利要求4所述的肽，该肽对S.aureus，E.coli，C.albicans，S.typhimurium和C.neoformans具有裂解活性。8.一种裂解致病菌，减少致病菌数量的方法，该方法包括将有效剂量的权利要求1所述的肽作为组分之一处理致病菌或感染致病菌的宿主。9.权利要求8所述的致病菌减少包括减少90％-99％。全文摘要本专利技术提供了来自结核分枝杆菌噬菌体的新抗菌肽。该肽命名为结核分枝杆菌裂解肽MBL－1。从分枝杆菌噬菌体纯化了MBL－1。本专利技术提供了相关的氨基酸序列。纯化的MBL－本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离自分枝杆菌噬菌体的裂解肽，包括下列氨基酸ＥＶＴＸＸＸＳＧＣＡＳＥＣＴＸＸＴＤＫＣＮＲＡＲＧＧ，其中Ｘ为任意氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢建平，胡昌华，谈锋，
申请(专利权)人：西南师范大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]