血管内皮细胞生长因子(VEGF)肽及其抑制血管生成的用途制造技术

具有部分或全部氨基酸序列ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ（其为ＶＥＧＦ的部分）的肽具有抑制血管生成的能力。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有潜在治疗益处的VEGF(血管内皮细胞生长因子)肽片段。
技术介绍
VEGF是分泌型多肽，为胚胎发生时形成血管所必须，且在多种疾病状态的血管生成中起重要作用。在多种细胞类型中组织缺氧和一些细胞因子上调VEGF的表达，并由此引起多种体内和体外生物活性，包括内皮细胞的分化、增殖、迁移和存活，血管通透性增加，单核细胞迁移及内皮生产血管舒张因子NO和前列环素的增加。VEGF引起的NO和前列环素生产又出现于血管发生和VEGF的一些血管保护性作用中，包括增加通透性，和抑制血管内膜(intimal)血管平滑肌细胞增生和血栓。人VEGF存在由不同的mRNA剪接产生的121，145，165，189和206个氨基酸的多种同工型，其中VEGF121，VEGF145和VEGF165已知为分泌型且具有生物活性。已经鉴定了VEGF的两种不同的蛋白质酪氨酸激酶受体，Flt-1(VEGFR1)和KDR/Flk-1(VEGFR2)。认为KDR/Flk-1是主要介导VEGF在内皮细胞中的促有丝分裂作用和在体内的血管生成作用；Flt-1在内皮细胞中的作用未知。非-酪氨酸激酶跨膜蛋白，已经鉴定了neuropilin-1(NP-1)作为VEGF的另一受体，其特异结合VEGF165，并增强VEGF165同VEGFR2的结合。NP-1在调节VEGF的生物功能中的作用在很大程度上未知。专利技术简述意外地发现VEGF的片段具有抗血管生成作用。其可能具有VEGF拮抗物活性。根据本专利技术，具有氨基酸序列QKRKRKKSRYKSWSVP(SEQ IDNo.1)的肽，其中任何Y残基至少可以由其等配物或片段或衍生物或同源物代替；这样的肽抑制血管生成。该序列对应VEGF中的氨基酸125-140。本专利技术也包括该序列的变体，其中在无意外结构变化时保持新活性，即抑制血管生成。因此，所给序列可以包括使该肽相对稳定的同配或同源代替或衍化。专利技术详述本专利技术的肽可以通过已知方法合成。以下给出实施例。其可以已知方式配制并应用。该肽的抗-血管生成活性意味着其可用于治疗癌症。该氨基酸序列的关键特点可能是碱性残基如K和R的存在和排列。本专利技术的肽优选包括1，2或更多KK，KR或RK序列，例如由非碱性残基间隔。本专利技术的典型肽具有至少4个氨基酸。可以多达6或8个氨基酸，但是优选尽可能短。本专利技术的肽可以是环化的，例如尾对尾，或通过取代/引入2个Cys残基。环化步骤已知；见，例如，Tam等人，JACS 1136657-62(1991)。也可以用其他环化，例如，Mitsunobu或烯烃复分解环闭合。环肽可能表现增强的特性。如上所示，本专利技术的肽包括对给定序列的修饰。这些修饰为本领域技术人员熟知。同配代替包括Abu代替Cys(当肽中需要保持偶数个Cys残基进行环化时，这可能有益)，Phe代替Tyr及不同的烷基/芳基取代。在一个氨基酸残基中，从C原子到N原子的取代基移位来产生对蛋白水解有更强耐受的肽，和其他修饰，已知并属于本专利技术的范围。本专利技术肽的抗-血管生成特性可由下述步骤确定。活性水平优选至少等于作为初始测试对象的两种线性12肽，即，QKRKRKKSRYKS(V125-136；SEQ ID No.2)和RKKSRYKSWSVP(V129-140；SEQ ID No.3)。本专利技术的进一步的实例是SEQ ID Nos.4-21；也见图2。本专利技术肽的活性意味其可用于治疗其中血管生成是重要病理因素的疾病。这些包括眼的血管生成疾病如糖尿病的视网膜病，或者其中可能有血管生成的疾病如ARDS(衰老相关的黄斑变性)。血管生成起重要作用的其他疾病有肿瘤生长，或子宫内膜易位，和例如牛皮癣的皮肤病。该肽可用于治疗具体的癌症，包括卡波济氏肉瘤(其发生于AIDS患者)，皮肤和眼的恶性黑色素瘤，和卵巢、乳腺、肺、胰腺、前列腺、直肠的实体恶性肿瘤及表皮样癌(epidermoid cancer)。其也可用于治疗具有血管成分作为炎症状况的风湿性关节炎。用于治疗用途，可由本领域已知步骤，使用本领域已知成分配制并施用本专利技术的肽。本领域技术人员可根据具体要求，如对象的状态，化合物的作用强度，给药途径等因素选择适合的肽剂量。以下实施例解说本专利技术。缩写说明MBHA，甲基二甲苯基胺；Fmoc，9-芴基甲氧基-羰基；Ala，苯丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰氨；Asp，天冬氨酸；Abu，氨基丁酸；Cys，半胱氨酸；Gln，谷氨酰氨；Glu，谷氨酸；Gly，甘氨酸；His，组氨酸；Ile，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸；Met，甲硫氨酸；Phe，苯丙氨酸；Pro，脯氨酸；Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Pmc，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；Trt，三苯甲基；tBu，叔丁基；Boc，丁氧基羰基；Pybop，苯并三唑-1-基氧三吡咯烷膦六氟磷酸(benzotriazol- 1-yloxytris pryrolidino phosphonium hexafluoro phosphate)；NMM，N-甲基吗啉；DCM，二氯甲烷；DMF，二甲基甲酰胺；TFA，三氟乙酸；HPLC，高效液相色谱；LC-MS，液相色谱-质谱；AAA，氨基酸分析；DMSO，二甲基亚砜；VEGF，血管内皮生长因子；TBME，叔丁基甲基酯。肽合成用固相方法在自动AMS 422多肽合成仪上合成所有的肽。应用Rink Amide MBHA树脂(0.59和0.68mmol/g负载)和N-Fmoc策略正交保护要环化的衍生物的Cys侧链。例如，以25微摩尔规模合成QKRKRKKSRYKS(V125-136)和RKKSRYKSWSVP(V129-140)并进行一次30分钟的碱偶联。树脂和氨基酸衍生物，Fmoc-Ala-OH.H2O，Fmoc-Arg(Pbf/Pmc)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Pro.H2O，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Trp(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH购自Calbiochem-NovabiochemUK Lid.(伯明汉，英国)或Alexis(伯明汉，英国)。用Pybop(Calbiochem-Novabiochem)和NMM(RathburnChemicals，Walkerburn，苏格兰)作偶联剂通过活性酯方法将各氨基酸顺序偶联成从C到N生长的肽链。用DMF中20％的哌啶去N-Fmoc保护基，然后依次用DMF和DCM清洗。合成各肽以后，以Rink AmideMBHA树脂取代为基础，用4倍过量的乙酸(0.7摩尔，RathburnChemicals)进行自动乙酰化。将偶联本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有氨基酸序列：ＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫＳＷＳＶＰ的肽，其中任何Ｙ残基可以由其等配物或同源物或其片段代替；且该肽抑制血管生成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D塞尔伍德，I扎卡里，贾海燕，M勒尔，D戴维斯，
申请(专利权)人：ARK治疗学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]