一株大花绿绒蒿内生真菌DH24及其生产Pyrrocidines类化合物的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株大花绿绒蒿内生真菌DH24及其在发酵生产Pyrrocidines类化合物中的应用。所述大花绿绒蒿内生真菌DH24菌株已于2016年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60081，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明专利技术的西藏藏药材内生真菌DH24能产生独特结构的Pyrrocidines类化合物，经测试该化合物有体外抗肿瘤、体外抗真菌等活性。而且，本发明专利技术真菌DH24发酵工艺简单，周期短，生产活性化合物的成本低，节能环保，是开发新型天然药物的理想载体，易于扩大生产，适用于大规模生产，应用前景好。

【技术实现步骤摘要】
一株大花绿绒蒿内生真菌DH24及其生产Pyrrocidines类化合物的应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一株大花绿绒蒿内生真菌DH24及其在发酵生产Pyrrocidines类化合物中的应用。
技术介绍
青藏高原地区由于其高寒高海拔的独特环境，造就了生长在高原的独特藏药材。大花绿绒蒿（MeconopsisgrandisPrain）是罂粟科绿绒蒿属植物，在海拔高度为3000～5500m的高寒地带，是西藏特有植物，素有高原美人之称。大花绿绒蒿是重要藏药毛瓣绿绒蒿的代用药，全草入药，具有清热解毒、利尿、消炎、止痛、镇咳功效，用于肺炎、肝炎、咳喘等疾病的治疗。因人工种植不易，大花绿绒蒿作为毛瓣绿绒蒿代用药成为了濒危植物。为了研究内生真菌在濒危植物保护中的生态学意义，探讨内生真菌次级代谢产物对濒危藏药的保护及对濒危藏药次级代谢生物合成的互惠关系，并寻找新的药物先导化合物，课题组对多种濒危藏药进行了内生真菌的系统分离研究，从原生态大花绿绒蒿活株中分离得到了40多株内生真菌，大都具有很好的应用前景。因此，大花绿绒蒿是一种丰富的功能内生真菌来源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株青藏高原藏药材大花绿绒蒿内生真菌DH24。本专利技术另一目的是提供上述大花绿绒蒿内生真菌DH24在发酵生产Pyrrocidines类化合物中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一株青藏高原藏药材大花绿绒蒿内生真菌DH24，该菌株于2016年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60081，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本专利技术上述的大花绿绒蒿内生真菌DH24，分离自西藏高原特色藏药材大花绿绒蒿（MeconopsisgrandisPrain）根部，经ITSrRNA鉴定为新丛赤壳菌属（Neonectriasp.）真菌（该菌株的ITSrDNA序列如SEQIDNO.1所示）。该菌株的生物学特性为：在PDA培养基上，20～25℃恒温培养时，菌落表面为土黄色短绒毛状，背面为黄褐色，扩散性生长，有孢子生成。为好氧型真菌。该菌株在不同发酵方法中，能够用于生产Pyrrocidines系列化合物。所生产的Pyrrocidines系列化合物具有明显的抗多种肿瘤细胞株的活性。本专利技术生产方便，成本低，节能环保，是开发天然药物的一种理想载体。因此，本专利技术所述大花绿绒蒿内生真菌DH24在发酵生产Pyrrocidines类化合物中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。所述Pyrrocidines类化合物是指pyrrocidineA化合物和/或pyrrocidineB化合物等。本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术的西藏藏药材内生真菌DH24能产生独特结构的Pyrrocidines类化合物，经测试该化合物有体外抗肿瘤、体外抗真菌等活性。（2）本专利技术真菌DH24发酵工艺简单，生产活性化合物的成本低，节能环保，是开发新型天然药物的理想载体。（3）本专利技术真菌DH24发酵和生产活性化合物的周期短，分离制备较简单，易于扩大生产，适用于大规模生产。附图说明图1为本专利技术pyrrocidineA化合物的核磁共振氢谱。图2为本专利技术pyrrocidineA化合物的核磁共振碳谱。图3为本专利技术pyrrocidineA化合物的H,H-cosy二维谱。图4为本专利技术pyrrocidineA化合物的HSQC二维谱。图5为本专利技术pyrrocidineA化合物的HMBC二维谱。图6为本专利技术pyrrocidineB化合物的核磁共振氢谱。图7为本专利技术pyrrocidineB化合物的核磁共振碳谱。图8为本专利技术pyrrocidineB化合物的H,H-cosy二维谱。图9为本专利技术pyrrocidineB化合物的HSQC二维谱。图10为本专利技术pyrrocidineB化合物的HMBC二维谱。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1大花绿绒蒿内生真菌DH24的分离鉴定1、菌株的分离藏药材大花绿绒蒿：由西藏自治区高原生物研究所陈彬等人采集于西藏自治区山南地区错那县。通过对新鲜的藏药材大花绿绒蒿根部消毒，并削去外层根皮，切成小块状，无菌条件下接种到PDA培养基、Martin培养基或查氏培养基，室温培养（15～25℃）以下培养5～20天，得到单菌落。所得到的单菌落采用普通PDA培养基斜面4℃保藏。DH24菌落形态为土黄色短绒毛状菌丝，背面为黄褐色，有孢子生成。2、菌株的分离采用CTAB法提取上述分离到的藏药材内生真菌单菌落的纯培养的DNA，采用ITS间隔区的一对引物ITS1F和ITS4通过PCR扩增仪扩增ITS-rRNA基因片段，反应体系为50uL，反应条件为：94℃预变性5min,94℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸1min，重复变性、退火和延伸三个步骤30个循环，最后72℃延伸补齐10min。通过葡聚糖凝胶电泳检测确定目标片段在600bp左右，通过测序得出菌株的ITS-rRNA基因片段序列（如SEQIDNO.1所示），在GenBank上通过BLAST在线比对搜索引擎对序列进行相似性分析，得到最大相似度为99%的菌株，确定该菌株为Neonectriasp.属的真菌，命名为Neonectriasp.DH24，并于2016年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60081，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2菌株DH24的发酵和Pyrrocidines类化合物的提取、分离纯化1、方案1：采用马铃薯葡萄糖液体培养基，在盛有已消毒的马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中接入藏药材内生真菌DH24菌株的菌种，20～25℃静置培养1个月，终止发酵。往每瓶发酵液中加入乙酸乙酯200mL，將菌体杀死，用纱布过滤，分离菌体和发酵液，发酵液用乙酸乙酯（乙酸乙酯：发酵液（v/v）2:1）萃取3遍，旋蒸浓缩；菌体经风扇吹干后用甲醇浸提3～4遍，浸提液经旋蒸浓缩后与发酵液的乙酸乙酯提取液合并。采用普通硅胶柱层析技术，用乙酸乙酯—石油醚体系（1:20,1:10,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1）进行洗脱，得到的1:1的组分，经石油醚—乙酸乙酯重结晶，得到化合物PyrrocidineB；母液经HPLC纯化，得到Bispyrrocidine；得到的1:2组分，经进一步分离纯化，得到化合物PyrrocidineA。2、方案2：采用大米固体培养基，在盛有大米固体培养基的三角瓶中接入藏药材内生真菌DH24菌株的菌种，20～25℃静置培养1个月。往三角瓶中加入甲醇-乙酸乙酯-氯仿（v/v/v=1:1:1）混合溶剂200mL，浸提3～4遍，旋蒸浓缩浸提液。得到的浸膏经普通硅胶柱层析技术，用乙酸乙酯—石油醚体系（1:20,1:10,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1）进行洗脱，得到的1:1的组分，经石油醚—乙酸乙酯重结晶，得到化合物PyrrocidineB；得到的1:2组分，经进一步分离纯化，得到化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株青藏高原藏药材大花绿绒蒿内生真菌DH24，其特征在于，该菌株于2016年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60081。

【技术特征摘要】
1.一株青藏高原藏药材大花绿绒蒿内生真菌DH24，其特征在于，该菌株于2016年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60081。2.根据权利要求1所述的大花绿绒蒿内生真菌DH24，其特征在于，该菌株的生物学特性为：在PDA培养基上，20～25℃恒温培...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彬，刘岚，蒋思萍，许佳怡，徐爱国，普布多吉，李静，
申请(专利权)人：西藏自治区高原生物研究所，中山大学，
类型：发明
国别省市：西藏,54