非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的PEG肽的方法技术

本发明专利技术涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽及其制备方法，以及应用该合成肽将ＰＥＧ特异性地结合至靶位点的方法。本发明专利技术能以高得多的收率提供其中ＰＥＧ与靶位点的胺基特异性地结合的ＰＥＧ结合肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法
本专利技术涉及将至少一个PEG(聚乙二醇)特异性地结合到具有至少两个支链胺基的合成肽的靶位点胺基的方法，本专利技术还进一步涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽及其生产方法，以及将PEG特异性地结合到合成肽的靶位点并通过离子交换色谱法进行纯化的方法。
技术介绍
将PEG结合到肽和蛋白质的技术基于Davis和Abuchowski的研究(Abuchowski A.等，J.Biol.Chem.，252，3571-3581，1977；Abuchowski A.等，J Biol.Chem.，252，3582-3586，1977)。PEG是一种具有H(OCH2CH2)nOH结构的亲水性、生物相容性且无害的聚合物，并已知当结合到肽和蛋白质时，其以与糖蛋白中的糖链相同的方式通过位阻抑制酶促代谢，由于结合有PEG的肽和蛋白质的分子尺寸增加而减少肾小球的滤过，从而增加生理活性的持续时间。多肽和PEG之间的共价结合公开于USP No.4179337中，并且据记载以PEG修饰蛋白质和酶可导致免疫原性和抗原性下降及在血液内的半衰期增加。为使PEG共价键合到多肽上，必须进行将PEG的末端羟基转变为反应性官能基的“活化”过程。作为“经活化的PEG”，可列举烷基化剂如PEG醛、PEG环氧化物和PEG tresylate、酰化剂如PEG酯，且典型实例为PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯。聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺碳酸酯及其生产方法从Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)和USP No.512614等获知。可使用分子范围在2,000-40,000的PEG以及如甲氧基化的PEG和支化PEG等各种PEG。支化PEG可用R(-PEG-OH)m结构代表。羟基可用于化学修饰。还采用其它具有(CH3O-PEG-)pR-X(WO96/21469)结构的支化PEG。另一支化PEG的侧链PEG具有的官能团如羧基是在PEG骨架上，而不是在PEG链的末端。所有这些支化PEG都可通过前述“活化”过程使用。通常，在将“经活化的”PEG结合到肽胺基上的反应中，PEG非特异性地键合于一个或更多个胺基上，因此该技术的核心就在于将PEG分子特异性地结合到特定位置的胺基上的方法。然而，如果肽的氨基酸序列中包含至少一个赖氨酸，由于其中存在两个或更多个胺基，因此很难将PEG特异性结合到特定位点的胺基上。如果根据一般的方法将PEG结合到肽上则会产生多种结合物，从具有一个结合PEG的结合物到具有和胺的数目一样多的多重结合PEG的结合物，甚至当结合物仅含有一个PEG时(单PEG结合物)，也会形成PEG结合位点互不相同的位置异构体。通常，肽的PEG结合物的活性和酶促代谢根据结合PEG的数目及其结合位点的不同而不同，因此产生这种含有多种结合物的混合物的方法由于活性成分收率很低且又是混合物的原因是不利的。从混合物中分离纯化特定异构体是很复杂的，且收率低、成本高。为弥补这些缺点，已提出多种位点特异性聚乙二醇化的方法，然而，还未开发出将PEG特异性结合到特定位置的胺基上的有效方法。Chem.Pharm.Bull.39(12)3373-3375(1991)报道了与纤连蛋白相关的三肽(Arg-Gly-Asp)和氨基聚乙二醇的结合物及其活性。其中，提出一种通过将氨基PEG结合到以二环己基碳二亚胺(DCC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)活化的天冬氨酸而制备PEG结合物的方法。然而，该方法的缺陷在于它仅能用于C-端的修饰，并且在肽的C-端活化期间，可能出现相邻氨基酸的外消旋化。这种外消旋化可能出现于除甘氨酸之外的所有氨基酸中，结果导致肽活性的下降。用合成树脂将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)结合到肽上的方法发表于Journal of Protein Chemistry 10(6)623-627(1991)。因为从该方法仅能得到其中单一聚合物结合到肽N-端的结合物，因此其不能提供将PEG结合到能最大化聚乙二醇化效果的位置上的方法(最大化肽活性的持续时间并且最小化酶促代谢)。PCT专利申请No.PCT/US94/06953(1994)提供在肽合成过程中引入PEG的制备位点特异性PEG肽的方法。更确切地说，它提供一种制备PEG结合肽的方法，其中在序列到达靶位置的赖氨酸以前结合肽是部分合成的，然后结合PEG，最后合成肽的剩余部分得到完整的PEG肽；一种通过使用其中Nα-氨基用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)保护且其支链胺基与PEG结合的赖氨酸作为靶位点赖氨酸制备PEG肽的方法；一种其中单独合成具有PEG结合到靶位点胺基上的肽片段以及其余的肽片段再使之结合生成完整的PEG结合肽的方法。不过，由于先前结合的PEG对后续合成步骤的影响，这些方法可能带来不希望的结果。例如，如果在肽合成期间引入PEG并继续合成剩余部分，可能会产生氨基酸序列缺少至少一个氨基酸的肽，而这种肽可能对活体有害且几乎不可能纯化。因此，该方法作为制备用作药物的PEG结合肽的方法是不可取的。PCT专利申请No.PCT/EP98/07748提供多种方法用于在有机溶剂中将PEG结合到GRF的胺基上并通过凝胶色谱和反相色谱纯化所得的Lys(PEG)12-GRF、Lys(PEG)21-GRF、Lys(PEG)12，21-GRF以及-GRF的混合物。然而，该方法在Nα、Lys12和Lys21的胺基之间无特异性。所述专利同样也提供-GRF(1-29)与-GRF(1-29)的合成方法以及用它们进行的特异性聚乙二醇化方法，然而，就-GRF(1-29)而言，PEG仅能结合于Nα-胺基，而不能提供如上述专利所述的最有效的Lys21-PEG结合物的制备方法。此外，如果使用-GRF(1-29)制备PEG结合物，那么所形成的不是GRF(1-29)-NH2的PEG结合物，而是-GRF(1-29)-NH2的PEG结合物，即-GRF(1-29)。因此，该方法不能为具有N-端胺基的初始肽GRF(1-29)-NH2提供完全特异性的聚乙二醇化。本专利技术的专利技术者旨在开发通过形成其中PEG仅结合到靶位点胺基上的最终产物同时避免生成PEG结合到非靶位点胺基上的杂质产物的特异性聚乙二醇化方法，从而通过该方法可以明显提高产物收率并降低分离纯化最终产物所需的努力和费用。本专利技术提供制备特异性PEG结合肽的方法，其中通过使PEG完全选择性地仅结合于靶位点胺基而使PEG结合的效果最大化。
技术实现思路
本专利技术涉及非靶位点胺基被选择性地保护的合成肽，其制备方法以及将PEG特异性地结合到合成肽的靶位点的方法。更详细而言，本专利技术涉及(A)制备非靶位点胺基被选择性地保护的肽的方法，其包括用不同的可在不同的解封闭条件下除去的保护基{如，ivDde或Mtt(4-甲基一三苯甲基)和Boc(叔丁氧羰基)}分别封闭靶位点胺基和非靶位点胺基，以及用Fmoc或Nsc保护Nα-胺基，从而合成肽，(B)由所述方法制备的非靶位点胺基被选择性地保护的肽，以及(C)制备特异性结合PEG的肽的方法，其中PEG特异性地结合到靶位点胺基上，其包括(1)将所述肽与经活化的PEG反应，以及(2)在酸-碱解封闭条件下除去所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备非靶位点胺基被选择性地保护的肽的方法，其包括分别以ｉｖＤｄｅ或Ｍｔｔ、以及Ｂｏｃ封闭靶位点支链胺基与非靶位点支链胺基，以及以Ｆｍｏｃ或Ｎｓｃ保护Ｎ↑［α］－胺基，从而合成所述肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李相得，李康春，罗东熙，尹裕锡，
申请(专利权)人：派格斯菲尔有限公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]