结合红细胞生成素受体的新肽制造技术

本发明专利技术涉及肽化合物，其为红细胞生成素受体（ＥＰＯ－Ｒ）的激动剂。本发明专利技术还涉及使用此类肽化合物治疗与不足和有缺陷的血红细胞产生相关的疾病。还提供了包含本发明专利技术的肽化合物的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及肽化合物，其是红细胞生成素受体(EPO-R)的激动剂。本专利技术还涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞产生不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。还提供了包含本专利技术的肽化合物的药物组合物。
技术介绍
红细胞生成素(EPO)是具有165个氨基酸的糖蛋白激素，其分子量为约34千道尔顿(kD)，在24、38、83和126位氨基酸上优选具有糖基化位点。它最初以具有23个氨基酸的信号肽的前体蛋白质产生。EPO可以以三种形式α、β和脱唾液酸的形式发生。α和β形式在它们的糖组分中稍有不同，但是具有相同的效力、生物活性和分子量。脱唾液酸形式是除去末端糖(唾液酸)的α或β形式。已经报导了编码EPO的DNA序列。EPO刺激有丝分裂和红细胞前体细胞的分化，从而确保产生红细胞。当低氧条件占优势时，EPO在肾中产生。在红细胞前体细胞的EPO诱导的分化期间，诱导珠蛋白合成；刺激血红素复合体合成；并且铁蛋白受体数增加。这些改变允许细胞利用更多铁和合成功能血红蛋白，其在成熟红细胞中结合氧。从而，红细胞和它们的血红蛋白在为身体供氧中其关键作用。这些改变由EPO与红细胞前体细胞的细胞表面上的适宜受体的相互作用启动。当身体处于健康状态时，EPO以极低浓度存在于血浆中，其中组织从现有的红细胞接受足够的氧合作用。该正常的低浓度足够刺激通过老化正常损失的血红细胞的更替。在低氧条件下，此时循环中血细胞运输的氧减少，循环中EPO的量增加。例如，通过出血引起的大量失血、过量暴露于辐射导致血红细胞的破坏、由于高海拔或者长时间不省人事导致氧摄取减少，或者多种形式的贫血可以导致低氧。响应此类低氧应激，升高的EPO水平通过刺激红细胞类祖细胞增殖增加血红细胞产生。当循环中血红细胞数大于正常组织氧需求所需时，循环中的EPO水平降低。因为EPO是血红细胞形成过程中必需的，所以该激素在诊断和治疗特征是低或者有缺陷的血红细胞产生的血液疾病中具有潜在有用的应用。最近的研究已经为多种疾病状态、疾病和血液不规则性状态提供了设计EPO治疗功效的基础，所述疾病状态、疾病和血液不规则性状态包括β-地中海贫血；囊性纤维化；妊娠和月经失调；早产儿贫血；脊髓损伤；太空飞行；急性失血；老化；伴随着异常红细胞发生的多种瘤性疾病状态；和肾机能不全。已经表征了经纯化的同质EPO。纯化、克隆并表达了编码EPO的DNA序列以产生具有与天然EPO相同生物化学和免疫学性质的重组多肽。还产生了具有与天然EPO上寡糖相同的寡糖的重组EPO分子。EPO的生物学效应似乎部分通过与细胞膜结合的受体的相互作用介导。使用从小鼠脾脏分离的不成熟红细胞样细胞的初步研究表明结合EPO的细胞表面蛋白质包含两种多肽，它们分别具有约85,000道尔顿和100,000道尔顿的分子量。计算出EPO结合位点数平均为每个细胞表面800到1000个。在这些结合位点中，约300个以约90pM(皮摩尔)的Kd结合EPO，而剩下的以约570pM的更小亲和力结合EPO。独立的研究表明从注射弗罗德白血病病毒的贫血株系(FVA)的小鼠制备的EPO-反应性脾成红血细胞具有总共约400个高和低亲和性EPO结合位点，它们的Kd值分别为约100pM和800pM。随后的工作表明EPO受体(EPO-R)的两种形式由一种基因编码。该基因已被克隆。例如，在D′Andrea，等人的PCT公开号WO 90/08822中描述了鼠和人EPO-R蛋白质的DNA序列和编码的肽序列。当前的模型表明EPO与EPO-R的结合导致两种EPO-R分子的二聚化和激活，其导致随后的信号转导步骤。EPO-R的克隆基因的可得性促进了对该重要受体的激动剂和拮抗剂的研究。所述重组受体蛋白质的可得性允许在多种随机和半随机肽多样性产生系统中研究受体-配体相互作用。这些系统包括“质粒上肽”系统；“噬菌体上肽”系统；“编码的合成文库”(ESL)系统；和“极大规模固定化聚合物合成”系统。至少一定程度与EPO-R相互作用的肽已经得到鉴定并且在例如，Wrighton，等人的美国专利号5,773,569；5,830,851；和5,986,047；Wrighton，等人的PCT公开号WO 96/40749；Johnson和Zivin的美国专利号5,767,078和PCT公开号96/40772；Balu的PCT公开号WO01/38342；和Smith-Swintosky，等人的WO01/91780中描述。尤其，已经鉴定了一组含有肽基序的肽，该组肽的成员结合EPO-R并且刺激EPO-依赖性细胞增殖。然而，目前为止鉴定的含有所述基序的肽在体外以约20纳摩尔(nM)到约250nM的EC50值刺激EPO-依赖性细胞增殖。从而，需要约20nM到250nM的肽浓度刺激EPO刺激的最大细胞增殖的50％。考虑到EPO-R激动剂对于研究该受体介导的重要的生物活性和治疗疾病的巨大潜力，仍然需要鉴定具有增强的效力和活性的肽EPO-R激动剂。本专利技术提供了此类化合物。本章节中和整个说明书中的引用和/或对引用的参考文献的讨论仅仅提供用于阐明本专利技术的描述并且不是承认此类参考文献是本专利技术的“现有技术”。专利技术概述本专利技术的提供了新的肽化合物，其是具有显著增强的效力和活性的EPO-R激动剂。这些肽化合物是具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO1)的肽单体的同型二聚体，或者具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ ID NO2)的肽单体的同型二聚体、具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)(SEQ ID NO3)的肽单体的同型二聚体；其中每个氨基酸通过标准的单字母缩写表示，“(ACG)”是N-乙酰基甘氨酸，“(1-nal)”是1-萘基丙氨酸，“(MeG)”是N-甲基甘氨酸，也称作肌氨酸。肽二聚体的每种肽单体含有单体的半胱氨酸残基间的分子内二硫键。肽单体可以通过共价连接到分枝的叔酰胺连接体二聚化。该叔酰胺连接体可以描述为-C1O-CH2-X-CH2-C2O-其中X为NCO-(CH2)2-N1H-；连接体的C1与第一个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；连接体的C2与第二个肽单体的C-末端赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键；X的N1通过氨基甲酸酯键或者酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分，其中PEG具有约20,000到约40,000道尔顿的分子量(术语“约”指出在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量)。当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO1)并且连接体的N1通过氨基甲酸酯键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本专利技术的新肽化合物可以表示如下 当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK(SEQ ID NO1)并且连接体的N1通过酰胺键连接到活化的聚乙二醇(PEG)部分时，本专利技术的新肽化合物可以表示如下 当同型二聚体的每个单体具有氨基酸序列(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合并激活红细胞生成素受体（ＥＰＯ－Ｒ）的化合物，所述化合物包含具有式：＊＊＊的肽二聚体，其中（ｉ）在该肽二聚体的每个肽单体中，每个氨基酸通过标准单字母缩写表示，ＡｃＧ为Ｎ－乙酰基甘氨酸，１－ｎａｌ为１－萘基丙氨酸； （ｉｉ）该肽二聚体的每个肽单体含有每个单体的两个半胱氨酸（Ｃ）残基之间的分子内二硫键；（ｉｉｉ）［“ＰＥＧ”］包含至少一个线性聚乙二醇（ＰＥＧ）部分，每个ＰＥＧ部分具有约２０，０００到约４０，０００道尔顿的分子量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：CP霍姆斯，殷群，G拉隆德，P沙茨，D图梅蒂，B帕兰尼，GH泽梅德，
申请(专利权)人：阿费麦克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]