制备酪-丝-缬三肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用最小保护策略合成所述酪－丝－缬三肽的方法，所述方法包括步骤：（１）使Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ的酯与氨端保护但侧链羟基无保护的Ｌ－Ｓｅｒ－ＯＨ进行缩合反应；（２）对（１）的产物的氨端脱除保护基团；（３）使（２）的产物与氨端保护但侧链羟基无保护的Ｌ－Ｔｙｒ－ＯＨ进行缩合反应；（４）使（３）的产物进行水解皂化，得到氨端保护的Ｈ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－ＯＨ；（５）对（４）的产物的氨端进行脱除保护基团，得到酪－丝－缬三肽。相对于ＨＦ的脱保护条件，本发明专利技术方法的安全性增大，同时对工业化没有障碍。另外，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此本发明专利技术的方法成本小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本专利技术涉及酪-丝-缬三肽的制备方法。
技术介绍
在多肽合成方法中，常用的液相合成方法是采用最大保护策略，即对氨基酸的相关官能基团，尤其是氨基、羧基和羟基均作出保护，再进行氨基酸间的缩合反应最后脱去所有的保护基从而合成多肽。关于多肽合成的详细描述可参见《多肽合成》，1985年，黄惟德、陈常庆著；《多肽药物化学》，1990年，彭师奇。例如，在合成酪-丝-缬三肽时，采用最大保护策略方法，可以Boc-Val-OH为原料制备铯盐，接着将羧端苄酯化，随后用HCl脱去Boc，暴露出氨端，然后按照DCC法(HOBT为辅助缩合剂)和侧链用苄基(Bzl)保护的丝氨酸和2，6-二氯苄基(Dcb)保护的酪氨酸进行逐步接肽，接着采用HCl脱去Boc，最后用HF脱去各种保护基，得到酪-丝-缬三肽。最大保护策略采用侧链保护的氨基酸价格昂贵，在合成的最后需要经过剧烈的HF脱保护。由于HF的剧毒性，反应的危险性较大，必须具备专门的HF脱保护装置。而且由于这类脱保护装置的反应容器体积有限，每一次脱保护所得产品数量有限，因此限制了在产业上的应用。因此，需要一种避免采用强毒性和刺激性的HF进行脱保护、成本便宜且能够在工业上实施的合成酪-丝-缬三肽的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种采用最小保护策略合成所述酪-丝-缬三肽的方法，所述方法包括以下步骤(1)使L-Val-OH的酯与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Ser-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的丝氨酸和缬氨酸的二肽缩合物的酯；(2)对(1)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；(3)使(2)中制得的产物与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Tyr-0H在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、丝氨酸和缬氨酸的三肽缩合物的酯；(4)使(3)中制得的产物在有机溶剂中、在碱存在下进行水解皂化，得到氨端保护的H-Tyr-Ser-Val-OH；(5)对(4)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团，得到H-Tyr-Ser-Val-OH。进一步的，所述的方法还包括在步骤(5)后将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐。其中所述经C18反相柱纯化脱盐所用的洗脱液为含有反离子酸及有机溶剂的水溶液，洗脱方式可以采用等度或梯度洗脱。其中所述反离子酸为0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。在本专利技术的一个实施方式中，所述梯度洗脱为三步梯度洗脱，洗脱液分别为含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液。其中，将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐后进一步包括将收集的洗脱液进行冷冻干燥。进一步的，步骤(2)包括在得到目标化合物之前用甲醇/无水乙醚重结晶。所述用于氨端保护的保护基团为Boc。在步骤(1)和步骤(3)中所用的缩合剂均为DCC/HOBt。在步骤(1)和步骤(3)的反应中pH值均为8～9。在步骤(2)和步骤(5)中的脱保护采用HCl/乙酸乙酯进行，并且，在步骤(2)中所用的HCl/乙酸乙酯含有体积百分含量为2.5％的三异丙基硅烷。本专利技术的有益效果在于相对于HF的脱保护条件，本专利技术方法的安全性增大，同时对工业化没有障碍。另外，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此采用本专利技术的保护路线的合成成本也较小，而且不需要最大保护路线的昂贵的HF脱保护的装置。进一步的用C18反相柱纯化能够将得到的产物进行脱盐精制，从而提高产物的纯度。利用分别含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液作为C18反相柱纯化的洗脱液依次分三步进行梯度洗脱使分离效果更佳。步骤(2)中在得到目标化合物之前用甲醇/无水乙醚重结晶能够消除反应过程中带来的杂质，或者采用在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三异丙基硅烷(TIS)能够避免副反应发生，提高中间产物HCl·Ser-Val-OMe的纯度，并使下一步反应更顺利进行。本专利技术方法在制备过程中通过选择合适的反应条件，有效地防止副反应的发生，制得的产物经薄层层析测定为单点。附图说明图1为本专利技术的HCl·Ser-Val-OMe制备工艺流程图；图2为本专利技术的Boc-Tyr-Ser-Val-OMe制备工艺流程图；图3为本专利技术的HCl·Tyr-Ser-Val-OH制备工艺流程图；图4为本专利技术的产品脱盐流程图。具体实施例方式尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本专利技术是以下面的事实为基础由于1)酪-丝-缬三肽为仅含有三个氨基酸残基的小肽；2)酪氨酸和丝氨酸的侧链的羟基的亲核反应活性相对氨基较小；因此在合成过程中可以不对两个侧链的羟基进行保护。申请人将L-缬氨酸的酯与侧链不保护的丝氨酸和酪氨酸进行逐步接肽，皂化脱去酯基，最后脱去保护得到酪丝缬肽的盐，采用C18反相脱盐纯化，冻干得到酪丝缬肽纯品。该合成策略为最小保护策略。简明路线如下所示 1.Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备将H-Val-OH的酯用有机溶剂溶解，采用有机碱调节pH值至一定值(中性)。另一方面，将仅对氨基进行保护(醇羟基呈游离状态)的Boc-L-Ser-OH用溶剂溶解，加入缩合剂，随后在一定温度下与H-Val-OH的酯溶液混合反应，在反应过程中采用有机碱维持pH值在一定范围内。得到Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯。在该步反应中采用Boc-作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用NMM。在该步反应中选用DCC/HOBt作为缩合剂，此外所述缩合剂还可选自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意缩合剂。在反应过程中，当pH较低时，反应产物的纯度将降低，而pH太高时，将使产率降低。因此，优选将pH控制在8～9范围内。反应温度可为-10℃至室温。2.脱保护Boc保护的二肽缩合物的脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。其中优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。Boc-Ser-Val-OMe二肽用HCl/EtOAc脱保护时，薄层层析显示在产物的上方会出现一个较大的杂点(＞15％)。该副产物在HPLC-MS得到证实，在主峰保留时间后面出现了一个较大的质量数比主峰多56的杂峰，并且脱保护反应过程中没有出现沉淀，可能因为该副反应的发生使沉淀难以形成。为了提高纯度，在该步中得到目标化合物之前需要用甲醇/无水乙醚重结晶，具体步骤是先将样品用一定体积(尽量少)的甲醇溶解，然后分次逐步加入乙醚，使溶液出现乳浊状，放置静置。或采用脱保护过程中在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三异丙基硅烷(TIS)能够抑制副反应的发生。3.Boc保护的缬氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备Boc保护的缬氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备条件的选择与Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备条件的选择类似。在该步反应中采用Boc作为氨基保护剂，此外所述氨基保护本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备具有以下结构的三肽化合物的方法：＊＊＊（Ｈ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－ＯＨ）所述方法包括以下步骤：（１）使Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ的酯与氨端保护但侧链的羟基无需保护的Ｌ－Ｓｅｒ－ＯＨ在缩合剂存在下进行缩合反应，制得 氨端保护的丝氨酸和缬氨酸的二肽缩合物的酯；（２）对（１）中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；（３）使（２）中制得的产物与氨端保护但侧链的羟基无需保护的Ｌ－Ｔｙｒ－ＯＨ在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、 丝氨酸和缬氨酸的三肽缩合物的酯；（４）使（３）中制得的产物在有机溶剂中、在碱存在下进行水解皂化，得到氨端保护的Ｈ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－ＯＨ；（５）对（４）中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团，得到Ｈ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ －Ｖａｌ－ＯＨ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁文锋，彭师奇，赵明，王超，林刚，
申请(专利权)人：康哲医药研究深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]