制备纯化脂肽的方法技术

本发明专利技术涉及脂肽的结晶性和晶体状形式，脂肽包括达托霉素，它是一种对革兰氏阳性细菌、包括对常规抗生素具有耐药性的菌株都具有有力杀菌活性的脂肽抗生素。本发明专利技术涉及纯化脂肽的方法，脂肽包括达托霉素，它是一种对革兰氏阳性细菌、包括对常规抗生素具有耐药性的菌株都具有有力杀菌活性的脂肽抗生素。本发明专利技术还涉及包含纯化形式脂肽的药物组合物和使用这些组合物的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及脂肽的结晶性与结晶状形式，包括达托霉素，它是一种脂肽抗生素，对革兰氏阳性细菌具有有力的杀菌活性，包括常规抗生素耐药性菌株。本专利技术还涉及制备脂肽的结晶性与晶体状形式的方法和纯化脂肽的方法，脂肽包括达托霉素。本专利技术还涉及包含脂肽的纯化形式的药物组合物和使用这些组合物的方法。专利技术的背景革兰氏阳性感染——包括由抗生素耐药性细菌导致的那些——发病率的迅速增加已经重新引起人们对开发新型抗生素的兴趣。其中一类是脂肽抗生素，它包括达托霉素。达托霉素对临床上有关的革兰氏阳性细菌具有有力的体外与体内杀菌活性，这些细菌导致严重的和危及生命的疾病。这些细菌包括但不限于耐药性病原体，例如万古霉素耐药性肠球菌(VRE)、甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)、糖肽中间体易感性金黄色葡萄球菌(GISA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和青霉素耐药性肺炎链球菌(PRSP)，对它们很少有可供替代的治疗剂。例如参见Tally等，1999，Exp.Opin.Invest.Drugs 81223-1238。达托霉素的抑制作用是一种迅速的、浓度依赖性体外与体内杀菌作用，和一种相对长效的、浓度依赖性体内抗生素后作用。达托霉素被Baltz描述在Biotechnology of Antibiotics，2nd Ed.，ed.W.R.Strohl(New YorkMarcel Dekker，Inc.)，1997，pp.415-435中。达托霉素也已知为LY 146032，是一种环状脂肽抗生素，它可以得自玫瑰孢链霉菌的发酵作用。达托霉素是玫瑰孢链霉菌的因子A-21978C0型抗生素的成员，由癸酰基侧链连接于环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸而成(附图说明图1)。达托霉素具有优异的活性，因为它对大多数革兰氏阳性细菌是非常有效的；它的杀菌性高，起效迅速；它的耐药性比率低，对抗生素耐药性生物是有效的。该化合物目前正被开发为多种制剂，治疗由细菌导致的严重感染，包括但不限于甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。大量美国专利描述了A-21978C0抗生素和达托霉素相关性脂肽，包括达托霉素(LY 146032)。这些专利还描述生产和分离A-21978C0抗生素和达托霉素相关性脂肽的方法。美国专利RE32,333、RE32,455、4,800,157、4,874,843和4,885,243描述了从玫瑰孢链霉菌的发酵培养物合成和分离达托霉素的方法。美国专利RE32,310、RE32,311、4,537,717、4,482,487和4,524,135描述了A-21978C0抗生素和脱酰化A-21978C0抗生素与再酰化肽核的方法，和由这种方法制成的抗生素衍生物。美国专利5,912,226(以下称为’226专利)描述了在达托霉素的制造期间生成的两种杂质的鉴别和分离，它们是脱水达托霉素和达托霉素的β-异构体形式。这些美国专利都没有公开以一定方式使脂肽沉淀或结晶的方法，以增加脂肽的纯度。美国专利4,439,425(以下称为’425专利)公开了结晶性脂肽和使该脂肽结晶的方法。公开在’425专利中的脂肽在结构上不同于达托霉素和达托霉素相关性脂肽。美国专利5,336,756(以下称为’756专利)也公开了包含六肽的结晶性环状脂肽。公开在’756专利中的结晶性环状脂肽也在结构上不同于达托霉素和达托霉素相关性脂肽。’756专利公开了脂肽是一种棘白菌素型化合物，当采用含水正丙醇作为结晶溶剂时可以得到之。例如参见’756专利第1-2栏。’425专利和’756专利既没有公开使达托霉素或达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀的方法，也没有公开使由链霉菌产生的脂肽结晶或沉淀的方法。开发一种使达托霉素和达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀的方法将是有利的，以提供这些脂肽的改进纯化方法。另外，达托霉素或其他达托霉素相关性脂肽的结晶形式或高度纯化的沉淀形式将可用于配制治疗细菌感染的药物组合物。进而，达托霉素或达托霉素相关性脂肽的结晶形式或高度纯化的沉淀形式将可用在制备无菌产品、特别是大量无菌产品的方法中。因而，存在对生产结晶性或沉淀的达托霉素和达托霉素相关性脂肽的方法和由此生产的脂肽的结晶或沉淀形式的需要。不过，尚不存在简单和稳健的方法有效使达托霉素或达托霉素相关性脂肽结晶或沉淀，生成在结晶或沉淀后比以前更纯的脂肽。专利技术概述本专利技术为解决这些问题，提供脂肽、特别是达托霉素和达托霉素相关性脂肽的结晶性与结晶状形式，和生产它们的方法。在一种实施方式中，本专利技术提供使脂肽结晶的方法。在另一种实施方式中，这些方法提供在结晶或沉淀后比以前的结晶或沉淀更纯的脂肽。本专利技术还提供稳健的生产和纯化脂肽的方法，尤其包含使脂肽结晶或沉淀。在一种实施方式中，这些方法的结晶或沉淀步骤用于纯化脂肽。在另一种实施方式中，这些方法用于脂肽、优选达托霉素的大规模和/或商业生产。本专利技术进一步提供高度纯化的达托霉素和达托霉素相关性脂肽的结晶性或晶体状形式。在一种实施方式中，脂肽的结晶性或晶体状形式可以用在药物组合物中。在另一种实施方式中，本专利技术包含使用这些药物组合物的方法。附图的简要说明图1显示达托霉素的结构。图2显示由实施例12所述方法生产的达托霉素的urchin状晶体或晶体状粒子的显微照片。图3显示达托霉素的针状晶体的显微照片。图4显示达托霉素的棒状晶体的显微照片。图5显示达托霉素样本在100X放大率下的显微照片。无定形达托霉素的显微照片是用平面透射光(A)和正交偏振光(B)显示的。达托霉素晶体的显微照片是用平面透射光(C和E)和正交偏振光(D和F)显示的。达托霉素晶体是由实施例7所公开的方案生产的。图6显示无定形达托霉素的X-射线粉末衍射图样。图7显示由实施例7所述方案生产的达托霉素晶体的X-射线粉末衍射图样。图8显示由实施例7所述方案生产的第二份达托霉素晶体状本的X-射线粉末衍射图样。图9显示达托霉素的晶体状粒子在曝露于偏振光时的双折射。晶体状粒子是由实施例12所述方法生产的。图10显示示范性结晶方法的流程图。图11显示不采用结晶或沉淀的示范性制造方法的流程图。该制造方法采用细菌发酵，生成含有达托霉素的发酵培养物，然后利用微过滤、阴离子交换色谱、尺寸排阻超滤、疏水作用色谱、用于溶剂除去的阴离子交换色谱、用于热原除去的超滤、反渗透来纯化达托霉素，再将达托霉素装瓶。例如参见2001年6月21日公布的国际PCT公报WO 01/44274，引用在此作为这种方法的详细说明参考。图12显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、阴离子交换色谱、尺寸排阻超滤、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例13。图13显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、阴离子交换色谱、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例14。图14显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、尺寸排阻超滤、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例15。图15显示脂肽化合物的示范性制造方法的流程图，该方法包含发酵、微过滤、结晶或沉淀、晶体或沉淀的干燥和化合物的无水装瓶等步骤。例如参见实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
结晶性或晶体状脂肽或其盐，其中该脂肽选自由达托霉素、Ａ５４１４５和达托霉素相关性脂肽组成的组。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D凯斯，赖正吉，C戈瓦尔丹，N哈拉夫，
申请(专利权)人：卡比斯特制药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]