免疫原性复合物、其制备方法及其在药物组合物中的应用技术

本发明专利技术涉及通过用小支持肽偶联来提高免疫原、抗原或半抗原免疫原性的方法。更具体地说，本发明专利技术涉及制备免疫原性复合物的方法，以及使用这种方法能获得的复合物，还涉及所述复合物作为用于增加免疫原的免疫原性的药物的用途。例如，本发明专利技术包含与呼吸道合胞体病毒（ＲＳＶ）的Ｇ蛋白偶联的支持肽，并涉及其作为疫苗用于治疗与ＲＳＶ相关呼吸道感染的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过用小支持肽偶联来提高免疫原、抗原或半抗原的免疫原性的方法。更具体地，本专利技术涉及制备免疫原性复合物的方法，以及能够通过这种方法获得的复合物，以及所述复合物作为药物以增加免疫原的免疫原性的用途。例如，本专利技术包含与来自呼吸道合胞体病毒(RSV)G蛋白的肽偶联的支持肽，及其作为疫苗用于治疗RSV相关呼吸感染的用途。免疫系统是一种相互作用的体液和细胞组分的网络，其允许宿主区分自身分子和非自身分子，以去除后者以及病原体。为此目的，免疫系统已经发展了能协同作用的两种机制，也就是自然免疫和获得性免疫。自然免疫包括物理屏障(皮肤、粘膜等)、在对攻击应答中活化或产生的细胞(单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、NK细胞等)和可溶性因子(补体、细胞因子、急性期蛋白等)。自然免疫应答是快速的，但是它既不是特异性的，又不被记忆。获得性免疫的细胞介质是T和B淋巴细胞。特别是，通过它们的相互作用，后者产生免疫球蛋白。与自然免疫应答相比，获得性免疫的免疫应答是特异性的、可适应的并且能被记忆。事实上，抗原初次侵入幼稚(nive)生物体导致免疫应答，称为初次应答，在此期间，称为记忆细胞的长寿淋巴细胞(T和B)扩增。通过这些细胞，在相同抗原的二次渗透期间，称为二次反应的免疫应答将更快和更强。要发生初次应答，抗原首先必须被捕获并由抗原呈递细胞准备，以呈递给T淋巴细胞。疫苗的目的是通过预防或限制病原体入侵来保护宿主。现在市场销售的所有疫苗都通过引起待产生的抗体来实现这种作用。当单独接种抗原不能引发免疫应答时，或者如果产生了免疫应答但是太弱时，它与具有能与T淋巴细胞相互作用的T表位的所谓载体蛋白的物理结合物能够引发期望的应答。最普遍已知的疫苗载体蛋白是白喉和破伤风类毒素。在这些载体蛋白中，也可以引用链球菌G蛋白的所谓“BB”蛋白片段，其能与白蛋白结合并且是对应SEQ ID NO 1序列的第24-242位残基的片段。这种蛋白能引发与之结合的接种抗原更早和更强的初次抗体应答(Libon et al.，Vaccine，17(5)406-41，1999)。在本文中，也可以参考国际专利申请WO 96/14416。本专利技术的目的是提供载体蛋白的替代物，其将如以下说明书中所述，弥补与这种载体蛋白相关的所有缺点。更具体的说，本专利技术能够限制与存在相对较大载体蛋白相关的副作用而同时允许实现高产量。为了明确，通过与现有的载体蛋白，即BB载体蛋白，相比较，来证明本专利技术的优点。非常出乎预料地，并且与本领域技术人员所接受的主流知识相反，专利技术人已经证明了使用载体蛋白的替代物。更具体的说，本专利技术人已经表征了提高免疫原的免疫原性的方法，这是基于鉴定非常小并因此非免疫原性的肽，此后其被称作支持肽，这有助于其合成和/或它们参与其中的免疫原-支持肽复合物的合成。为此目的，本专利技术涉及制备免疫原性复合物的方法，其中免疫原、抗原或半抗原与支持肽偶联从而形成所述的免疫原性复合物，其中所述支持肽由少于10个氨基酸的肽组成，其至少包含SEQ ID NO 2序列的3氨基酸残基肽片段(Met-Glu-Phe)。术语“免疫原”包括能引起免疫应答的任何物质。作为非限制性实例，免疫原优选是蛋白质、糖蛋白、脂肽或在其结构中包含至少5个氨基酸，优选至少10、15、20、25、30或50个氨基酸，的任何免疫原性化合物，所述化合物在施用于哺乳动物后能引起免疫应答，尤其是能诱导产生抗所述肽的特异性抗体。在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“蛋白质”可以互换。对于以上说明，应该清楚理解的是，表述“支持肽”不等同于“载体蛋白”。实际上，载体蛋白的特征在于它的大尺寸(对于BB蛋白为218个氨基酸)，最重要的是其存在能与T淋巴细胞表面上T抗原受体结合的T表位。由于支持肽小得多(小于10个氨基酸)的事实和支持肽不表现T表位的事实，根据本专利技术的支持肽与载体蛋白不同。根据第一优势方面，根据本专利技术的方法使得有可能生产提高免疫原的免疫原性的免疫复合物，对此该生产更容易或者其产量更高。实际上，包含根据本专利技术支持肽的复合物远小于包含现有技术载体蛋白的复合物，通过肽/化学合成或本领域技术人员已知的任何其它技术，所述支持肽复合物更容易制备。根据第二优势方面，根据本专利技术的免疫原性复合物使得有可能去除，至少也是限制，与载体蛋白特别性质相关的不利作用。本领域技术人员所接受的是相对大的载体蛋白，比如BB，有更高可能性是不期望免疫应答的原因。例如，对于破伤风类毒素，已经显示宿主对这种载体蛋白预先敏化能在用偶联物接种疫苗期间防止发生抗与破伤风类毒素结合的抗原的抗体应答(Kaliyaperumal et al.，Eur.J.Immunol.，25(12)3375-80，1995)。这种现象被称为表位抑制。因而，从本说明书中很清楚的是，本专利技术提供了使用载体蛋白的有利的替代物。实际上，由于它的小尺寸，支持蛋白没有、或者有非常少的机会作为副作用或不期望作用的起源。根据本专利技术的一个优选实施方案，少于10个氨基酸的支持肽至少包含由SEQ ID NO 2编码的肽并且由至多8个氨基酸组成，优选至多5个氨基酸，更优选4个氨基酸。根据另一个优选实施方案，根据本专利技术的少于10个氨基酸的支持肽由SEQ ID NO 2序列的肽组成。通过本领域技术人员已知的保持免疫原完整性以及免疫原性的偶联技术，可以实施所述支持肽和免疫原之间的结合。更具体的是，根据本专利技术的方法的特征在于所述结合由共价偶联组成。术语“共价偶联”包括化学偶联或者通过所谓的重组DNA技术的蛋白质融合，其中通过用所述核酸转化的宿主细胞(真核或原核)在编码融合蛋白(免疫原性复合物)的核酸翻译之后获得所述融合蛋白。当所述免疫原是肽时，所述支持肽可以偶联在所述免疫原的N末端或C末端。优选的是，所述支持肽被偶联在所述免疫原的N末端。支持肽和寻求提高免疫原性的化合物之间的复合物能通过重组DNA技术产生，尤其是通过将编码免疫原的DNA插入或融合到编码支持物的DNA分子中。根据另一个实施方案，通过根据本领域技术人员已知的化学途径实施支持肽和免疫原之间的共价偶联。作为一个目的，本专利技术也提供一种方法，其中通过遗传重组(重组蛋白)来获得所述免疫原性复合物，其中遗传重组使用得自与编码免疫原的DNA融合(或插入)的、编码支持肽的DNA分子的核酸，如果必要用启动子。在此方法中，可以使用包含这种融合核酸的载体，特别是起源于质粒、噬菌体、病毒和/或粘粒的DNA载体并且融合核酸编码所述复合物的所述载体，其能整合到宿主细胞的基因组中，从而在其中表达。因此在其一个实施方案中，根据本专利技术的方法包括通过遗传工程在宿主细胞中产生所述复合物的步骤。宿主细胞可以是原核的，并且尤其是选自大肠杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、葡萄球菌和链球菌；它也可以是酵母。根据另一个方面，宿主细胞是真核细胞，比如哺乳动物细胞或昆虫细胞(Sf9)。编码免疫原性复合物的融合核酸尤其能通过病毒载体引入宿主细胞。所用免疫原优选来自细菌、寄生生物、病毒或与肿瘤相关的抗原，比如与黑素瘤相关或源自β-hCG的抗原。根据本专利技术的方法特别适合于病原体的表面多肽。当所述多肽通过重组DNA技术以融合蛋白的形式表达时，融合蛋白有利地被表达、锚定并暴露于宿主细胞膜的表面。所用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备免疫原性复合物的方法，其中免疫原、抗原或半抗原与支持肽结合形成所述免疫原性复合物，其中所述支持肽由至少包含ＳＥＱＩＤＮＯ２序列所示肽的少于１０个氨基酸的肽组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂娜利博，蒂恩恩古延，
申请(专利权)人：皮埃尔法布尔制药公司，
类型：发明
国别省市：FR[]