肽合成法制造技术

发明专利技术了一种新的酰胺化肽的Ｃ－末端羧基的方法，该方法避免了不希望的Ｃ－末端氨基酸的α－碳差向异构，产生酰胺化肽的非对映异构变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及药用多肽领域，即涉及增强这种肽生物活性的各种化学衍生方法。专利技术了通过化学方法酰胺化多肽C-末端的方法。已经清楚小肽药物是一类重要且有用的药物活性成分。例如，抗感染肽尤其是阳离子肽—US2003/0219854A1专利技术了它的工业生物技术制造方法—是一类新的广谱抗微生物物质，它可帮助抵抗病原微生物中多药物抗性向标准抗生素迅速传播。天然存在的抗感染肽包括翻译后修饰，如C-末端酰胺化，这对于持续的生物活性极为重要(Boman，Immunol.Rev.1735，2000)。例如，C-末端酰胺化除去了潜在的电荷并进一步防止被普遍存在的外肽酶迅速降解。尽管完全化学合成可以在合成过程中适当引入C-末端酰胺官能团(amidfunction)(例如，Han等，J.Org.Chem.1996，61，6326-6339；Albericio，F.和Barany，G.，Int.J.Peptide Protein Res.30，1987，206-216)，但处理来自大的头-尾肽多联体的单个肽的更经济的生物技术途径缺乏这种可能性。因此，按照US2003/0219854A1通过生物技术方法制造的肽必须在下游加工步骤中被C-末端酰胺化。然而迄今为止描述过的化学酰胺化方法需要在相当程度上外消旋肽主链。US2003/0219854描述了通过在存在近化学计量量(6当量(eq.))的脲偶联剂(HATUO-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)和辅活化剂N-羟基-9-氮杂苯并三唑时在非质子溶剂DMF中使过量的氨和碱试剂(20eq)反应，来末端酰胺化富含色氨酸的Boc保护的12聚体。酰胺化的、去保护的肽衍生物的产率号称为47％。小心重现该反应过程和反应产物分析(实施例部分)显示，低产率主要是由于不需要的C-末端氨基酸的差向异构，这导致了比例几乎为1∶1的两种酰胺化的非对映体，采用Tween20和Cyclodextrin CE法得到的电泳图证明了这一点。按照该申请实施例部分的详细描述，使用Marfey试剂作为水解肽的手性衍生剂，通过反向LC/ESI-MS串联色谱也证实了这一比例。这就是说，一半的产物由于C-末端氨基酸的有效外消旋而在酰胺化中损失。另一种仅用于固相合成的方法描述于Albericio，F.和Barany，G.，Int.J.PeptideProtein Res.30，1987，206-216。然而，该方法需要制备特别的FMOC-三烷氧基-苄基酰胺把手(handle)以功能化树脂支持物，因此比较复杂。将肽偶联并合成到支持物之后，从如此修饰的树脂上切下肽得到容易酰胺化的肽，所需非对映异构体或非对映体的光学纯度约为80％，加上较低的切割效率，使得所需酰胺化的肽的非对映异构体总产率仅为约60-70％。采用化学上略有不同的酰胺-把手的类似方法也由相同作者描述于US5306562。本专利技术的目的是避免现有技术的缺点和提供另一种或改进的酰胺化肽或氨基酸的未保护的α-羧基的化学的非酶方法。根据本专利技术，该目的是通过酰胺化氨基酸或肽的游离α-羧基的方法实现的，该方法包括使所述氨基酸或者优选所述肽在存在碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐的有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述氨基酸或肽的侧链和α-氨基官能团(function)被非碱不稳定性保护基保护。应理解，所述碱试剂和盐的铵阳离子优选不相同，因此不会形成共轭酸碱对。而且有第一种碱和第二种碱，且本专利技术中第二种碱是铵阳离子。下文中，术语“碱”通常仅指所述第一种碱。第二种碱将始终被称为铵化合物或铵阳离子。本专利技术方法的优点在于可使实际在其α-羧基上被酰胺化的氨基酸残基中α-碳原子的不利的差向异构最小化。在二肽或较高n聚肽中，该氨基酸残基是肽的C-末端残基，这是本专利技术特别优选的实施方案。本专利技术的肽或多肽可以是任何肽。保护侧链和α-氨基官能团能使适当保护的肽或氨基酸在有机溶剂中获得足够的溶解度。理所当然，本专利技术的溶剂条件被证明在保留构型时对于高效酰胺化是有利的，但考虑到不伤害较长肽的二级结构甚至三级结构，尤其是当这种二级或三级结构未被共价链内碱或类似结构稳定时，可以考虑使可能的非天然结构元件变性。优选地，本专利技术的肽包含100个或更少氨基酸残基，更优选包含50个或更少氨基酸残基，最优选包含20个或更少氨基酸残基。该定义包括含有非天然组成的肽，如D-氨基酸、具有修饰的侧链或异常侧链的L-或D-氨基酸、或者可能是连接上述肽内肽链不同部分的非氨基酸构件块。固相合成能够有效合成接近50个残基的肽，然而进一步液相片段缩合反应能够制造出更长的完整的合成肽。现在对通过生物技术制造的肽有长度限制。降低反应混合物的含水量以及适当排除其它质子溶剂，尤其是排除水之外的低级C1-C5烷基醇如甲醇、异丙醇或乙醇，对于本专利技术是优选的。优选地，所述肽是抗微生物或抗感染的杀菌肽，优选阳离子抗微生物肽，如ILRWPWWPWRRK、indolicidin，它们在其C-末端酰胺化形式更加有效。抗感染肽，尤其是阳离子肽如indolicidin衍生物以及尤其是ILRWPWWPWRRK-它们的工业生物技术制造方法描述于US2003/0219854A1—是一类新的广谱抗微生物物质，它可帮助抵抗病原微生物中多药物抗性向标准抗生素迅速传播。优选酰胺化反应在水含量低于25％(v/v)，更优选低于15％(v/v)，最优选低于5％(v/v)时进行。在另一优选实施方案中，反应在基本上不含水的条件下进行。这可包括采用例如新鲜蒸馏的溶剂或采用保护性氮气。优选有机溶剂是非质子有机溶剂，更优选是极性非质子有机溶剂。合适的例子有乙腈、二甲亚砜、二氯甲烷和N，N-二甲基-甲酰胺。最优选有机非质子溶剂是N，N-二甲基甲酰胺。优选酰胺化反应在-15℃至50℃下进行，且反应期间pH被控制在约pH8-9，优选被控制在约pH8.5。上述试剂类型如偶联剂、偶联添加剂和保护基是标准肽合成中熟知的，其本质是酰胺化反应，并描述于例如Bodansky，M.的《肽合成原则》(Principles of PeptideSynthesis)，第二版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993)。非碱不稳定性保护基是本领域熟知的，术语“碱不稳定”如本领域常规理解用来指在碱性pH下分离和/或被伯胺或仲胺氨解。合适的例子有，例如，2-硝基-甲氧基苯基氧硫基-、Aloc(烯丙氧基羰基)-、Z(苯甲酸基羰基)-、Boc(叔-丁氧基-羰基)-、Bpoc-(联苯基-基-异丙氧基-羰基)-基。包括碱不稳定的保护在内的正交保护方法当然不包括在本专利技术之内。是否需要用单一类型的保护基全面保护或用不同类型的保护基保护相同的肽或氨基酸取决于通过化学或生物技术方法合成的肽的来源以及该肽或氨基酸中所含侧链的类型。值得注意的是，这种非碱不稳定性基团的除去可能会受不同方法或不同反应条件的影响。例如，Nps(邻硝基-苯基氧硫基-)基团可通过巯基亲核试剂顺利除去，Z-基团可通过氢解除去，或者Alloc基团可通过Pd(I)-催化氢化除去。根据本专利技术，非碱不稳定性保护基宜在酸解酰胺化之后除去，例如Boc-、Z-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酰胺化氨基酸或者优选肽的游离α－羧基的方法，所述方法包括使所述氨基酸或肽在存在第一种碱并存在至少一种肽偶联添加剂的铵盐时在有机溶剂中与肽偶联剂反应的第一个步骤，其中所述铵阳离子选自氨、伯胺或仲胺，且其中所述氨基酸或肽的侧链和α－氨基官能团被非碱不稳定性保护基保护。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M吉罗，M维利尔，O韦尔比茨基，
申请(专利权)人：隆萨股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]