一种无指盘臭蛙抗菌肽及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物化学和生物医学领域，涉及一种无指盘臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途。将活体无指盘臭蛙经电刺激、收集分泌物、离心去沉淀、冷冻干燥、离子交换、凝胶过滤、反相层析分离纯化后得到无指盘臭蛙抗菌肽，命名为ＯｄｏｒｇｒｉｎＡ，由３３个氨基酸组成，理论分子量（ＭＷ）３３６５．８１Ｄ，实测分子量３３６５．２４Ｄ，理论等电点（ｐＩ）９．３１，全序列结构为：ＮＨ↓［２］－ＧＬＬＤＴＦＫＮＬＡＬＮＡＡＫＳＡＧＶＳＶＬＮＳＬＳＣＫＬＳＫＴＣ－ＣＯＯＨ。具有广谱抗菌活性，可用来生产抗菌药物和抗菌剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学和生物医学领域，涉及一种无指盘臭蛙皮肤分泌抗菌肽OdorgrinA及其制备方法和应用。
技术介绍
抗生素的发现是20世纪最辉煌的现代医药成果。由于抗生素的临床应用，许多曾被认为是致命的感染性疾病得以治愈，从而显著提高了人类的预期寿命。但由于过去30年来滥用和不合理使用抗生素，导致耐药菌株的广泛播散，使抗感染治疗又成了棘手的问题。例如，由于肺炎链球菌出现对青霉素、大环内酯类抗生素和氟喹喏酮类抗菌药物的耐药，使急性呼吸道感染变得难以控制。在国际上享有“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”美誉的万古霉素，也因为最近发现了相应的耐药细菌而面临着失效的危险。细菌对抗生素产生耐药性，使抗感染治疗失败，必然导致发病率和病死率的上升及医药费用的大幅增加，因此，病原体对抗生素产生耐药性是21世纪全球公共卫生面临的最严重的威胁之一。解决办法一方面是合理使用抗生素，尽量减少耐药菌株的出现，另一方面就是寻找新型的抗菌物质，这已经成为当前的研究热点。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点。不但能够抗细菌，而且能够抗真菌、抗原虫、抗肿瘤、抗病毒，还能够杀死哺乳动物的精子，对哺乳动物正常细胞却只有很低的毒性。由于抗菌肽具有和抗生素完全不同的抗菌机理，因此具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点；传统抗生素容易诱导细菌产生内毒素从而导致脓毒症，而有的抗菌肽可以与内毒素相互作用中和细菌内毒素从而抑制脓毒症的发生；有的抗菌肽除了具有抗菌活性以外还有促进伤口愈合的作用。所以尽管抗菌肽灭菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天，仍被认为是能取代现有抗生素的唯一选择。抗菌肽除了能够开发成新一代的临床抗菌药物外，利用其特性，还可以开发出其他临床药物。比如有的抗菌肽有促进伤口愈合的作用，可以据此开发出愈伤药；抗菌肽可以杀死精子，可以据此研制出具有抗菌作用的新型避孕药；抗菌肽对膜具有特异的亲和性，可以将只具膜亲和作用的抗菌肽衍生物和药物结合，以便该药物能精确地作用于靶部位，研制出“药物导弹”；抗菌肽的抗病毒作用最近几年才发现，虽然其机理还不是很清楚，但由于对HIV等病毒有抑制作用，因此正成为研究热点。抗菌肽除了在药用领域大有前途外，在其他领域也有良好的应用前景，比如抗菌肽基因可以转入动植物基因组中，从而培育出抗病新品种；抗菌肽可以用于食品的防腐保鲜；可以取代抗生素作为饲料添加剂；可以开发新型农药等等。目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前的可行性研究如德国已将从果蝇体内提取的抗菌肽用于治疗化疗和器官移植后出现的重度真菌感染；美国开始试用从猪体内中性白细胞中获得的抗菌肽治疗癌症病人在放疗和化疗后出现的口腔溃疡，并把这种抗菌肽制成喷雾剂放入人工呼吸机中治疗重度肺炎病人；加拿大采用人工合成抗菌肽用于治疗革兰氏阳性菌引起的尿道旁组织感染。再如，美国学者发现，从青蛙表皮提取的抗菌肽，不仅可以杀死性病病菌和艾滋病毒，还能杀死精子。不难想像，用这种抗菌肽制成的药品不仅能防治性病，还能当避孕药。另外，研究中还发现，抗菌肽扼杀癌细胞的效果显著，据悉，俄罗斯专家试用抗菌肽对黑色素瘤、卵巢癌和淋巴癌进行治疗，效果十分显著。显然，抗菌肽也为治疗癌症开辟了新的途径。两栖动物有自己的一套先天免疫系统，其核心就是抗菌肽。两栖动物皮肤已经被公认为是生物活性多肽和生物胺的巨大储存库，其皮肤分泌物中含有大量的生物活性分子，是天然的药物资源库。我国现有300多种两栖动物，其中多数为我国特有种，其中有些还是典型的中药或藏药材，显然，它们是一个不可多得的两栖动物活性物质的巨大宝库。无指盘臭蛙(Odorrana grahami)隶属两栖纲(AMPHIBIAN)无尾目(ANURA)蛙亚科(Raninae)。分布于四川、云南、贵州、湖南，为我国特有种。经我们研究发现，其皮肤分泌物具有抗菌活性。通过综合一系列的分离纯化技术，从其皮肤分泌物中分离纯化出了一种抗菌肽，取名为无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA，它具有广谱抗菌活性，尤其对普通金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和盘尼西林抗药性金黄色葡萄球菌(Penicillin-resistant Staphylococcus aureus)都具有相同的抗性，显然具有成为抗菌药物的潜力。专利技术人将本专利技术的抗菌肽OdorgrinA全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的具有广谱抗菌活性的无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA及其制备方法和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供如下技术方案无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA为我们首次从中国两栖动物无指盘臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到的一种单链多肽，由33个氨基酸组成，理论分子量(MW)为3365.81D，实测分子量为3365.24D，理论等电点(pI)为9.31，全序列结构为NH2-GLLDTFKNLALNAAKSAGVSVLNSLSCKLSKTC-COOH。也可以表示为 Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Phe-Lys-Asn-Leu-Ala-Leu-Asn-Ala-Ala-Lys-Ser-Ala-Gly-Val-Ser-Val-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Cys-Lys-Leu-Ser-Lys-Thr-Cys本专利技术采用的无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA的制备方法本方法包括粗提物的获取、阳离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、反相柱层析等步骤，将活体无指盘臭蛙经中度电刺激，收集分泌物，离心去除沉淀，冷冻干燥后，经阳离子交换、凝胶过滤、反相层析分离纯化后即得无指盘臭蛙抗菌肽OdorgrinA。具体方法如下粗提物的获取无指盘臭蛙用15V-35V电刺激，让其充分分泌，分泌物经离心，取上清冷冻干燥，得到粗提物。继续饲养动物，每间隔一周，继续按此法反复取样以得到足量的粗提物。阳离子交换柱层析粗提物溶于A液(0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2)，上阳离子交换柱，柱尺寸1.0cm×40.0cm，层析介质为CM-Sepharose fast flow。上样后，A液等梯度洗脱，然后A液-B液(B液为0.5mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，pH4.2)线性梯度洗脱，最后C液(C液为2mol/L NaCl-0.01mol/L的HAc缓冲液，PH4.2)等梯度洗脱。206nm下检测紫外吸收值，收集抗菌活性峰，冷冻干燥，得到阳离子交换样品。凝胶过滤柱层析阳离子交换样品溶于双蒸水，上凝胶过滤柱，柱尺寸1.6cm×100.0cm，层析介质为SephadexG-25，洗脱液为双蒸水，206nm下检测紫外吸收值。收集抗菌活性峰，得到凝胶过滤样品溶液。反相柱层析凝胶过滤样品溶液上反相柱，柱尺寸1.6cm×10.0cm，层析介质为SOUCE 15RPC，D液为5％的乙腈溶液，E液为95％的乙腈溶液，D液-E液梯度洗脱，然后E液等梯度洗脱，214nm下检测紫外吸收值。收集抗菌活性峰，得到初步提纯样品溶液。初步提纯样品溶液再进行第二次反相层析，上完样后，等梯度洗脱，D液为79％，E液为21％；然后线性梯度洗脱，起始D液为79％，E液为21％，梯度结束时D液为54％，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无指盘臭蛙抗菌肽，其特征是：单链多肽，由３３个Ｌ型或者Ｄ型异构体氨基酸组成，理论分子量ＭＷ为３３６５．８１Ｄ，实测分子量为３３６５．２４Ｄ，理论等电点ｐＩ为９．３１，全序列结构为：ＮＨ↓［２］－ＧＬＬＤＴＦＫＮＬＡＬＮＡＡＫＳＡ ＧＶＳＶＬＮＳＬＳＣＫＬＳＫＴＣ－ＣＯＯＨ或表示为：Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｓ ｎ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江建平，刘炯宇，谢锋，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]