用于固相肽合成的方法技术

本发明专利技术提供了一种合成二价水蛭肽的新方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及和改进了抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素(hirulog)”的固相肽合成方法。本专利技术还涉及相应的肽-固相接合产物，该产物含有结合于树脂的仍受保护的肽。凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。水蛭素是一种获自吸血水蛭——医用水蛭Hirudo medicinalis的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含65个氨基酸。业已证明了水蛭素第45-65位氨基酸的肽片段短肽类似物(即所谓的二价水蛭素)在治疗血栓症(一种危及生命的病症)中的有效性。Okayama等(1996，Chem.Pharm.Bull.441344-1350)和Steinmetzer等(1999，Eur.J.Biochem.265598-605)专利技术了在Wang树脂上固相合成不同二价水蛭素的方法，即将Fmoc氨基酸的C末端通过形成酯结合到被酯化为对-苄氧-苄醇基团的树脂上。使用Wang树脂需要用浓三氟乙酸将肽从树脂上切割下，其中树脂切割等于相伴进行的肽的完全脱保护(global deprotection)。从Wang树脂上通过酸解切割(Acidolytic cleavage)是在强酸性条件下进行了，且已知如果在酸水解过程中不使用清除剂，则该方法会不可避免地引起作为副反应的Trp残基不良烷基化(Giraud等，1999，J.Peptide Science 5457-461)。C末端Trp尤其容易发生该副反应(Atherton等，1988，Tetrahedron 44843-857)。烷基化是由Wang树脂接头苯氧基部分产生的芳香性碳鎓离子所造成的。-当二价水蛭素不含Trp残基时，它们在邻近C末端的位置含有Tyr残基。我们发现并在此首次报告在从Wang树脂切割下时，该Tyr残基同样倾向于对烷基化不稳定，并对产物纯度产生不良的影响。本专利技术的目的是消除现有技术中的缺点，提供不同的或改进的二价水蛭肽(Hirulog peptide)合成方法。通过肽-树脂偶联物和本专利技术的相应合成方法来实现该目的。在本专利技术中提供了一种用于对肽-固相偶联物进行分离和脱保护，最终获得肽的方法，所述肽优选具有式D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Tyr-Leu。所述肽-固相偶联物包括式I中的2-氯-三苯甲基手臂(handle) 其中A＝Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，或A＝Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，或A＝NH2-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-，且其中R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9是氨基侧链保护基团，R1是不溶性固相。上述肽序列是二价水蛭素-8(Hirulog-8)的肽序列(描述于EP-489 070)。它是水蛭素(65聚体，天然存在的强效凝血酶抑制剂)的20聚体二价衍生物。它是由水蛭素上功能上重要的、相连的结构基序组成的水蛭素上的活性位点结合基序D-Phe-Pro-Arg-Pro和羧基末端序列Asn9到Leu20，通过四甘氨酸间隔物桥接。在此，‘-D-Phe-’是指D-苯丙氨酸，不同于给定氨基酸(在此为Phe)的天然L-对映体。任选地，在本专利技术的另一目的中，式I中的基团A可为以下基团中的任意基团1.A＝P-X1-Tyr(R9)-X2-，其中X1是肽基部分，任选地包括位于各单独氨基酸侧链上的保护基，其具有0-200个，优选1-100个，最优选2-50个氨基酸，其中X2是与固相通过-O-或-NH-连接的任选地在侧链或末端被保护的单个氨基酸残基，X2最好不是Trp、Cys或Arg，且其中P是H(即得到NH2)或保护基，该保护基优选正交保护基(orthogonal protection group)或如下所定义的在强酸性条件下可去除的保护基，更优选该保护基选自Boc、Fmoc、Dde、Nps、Alloc、Z。应理解的是，根据上文所述，当其X2残基的侧链中包含氨基官能团(例如赖氨酸、高赖氨酸或诸如3-赖氨酸的结构性异构体)时，X2残基可以与树脂仅通过氨基醚官能团结合。反之，-O-连接可以是通过侧链或Cα羧基或侧链羟基官能团与手臂或接头相连的酯键或醚键。2.A＝P-X1-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1-Tyr(R9)-X23.A＝P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X24.A＝P-X1-0-3-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O或P-X1--0-3-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X25.A＝P-X1-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-或P-X1-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2P、X1、X2的定义通用于各种A和所得的肽-固相偶联物的可能实施方式中。我们发现并在此首次报道从Wang树脂上切下时，所述Tyr残基也同样倾向于发生不规则的烷基化，这会对产品的纯度产生不良影响。对于二价水蛭素而言，这种修饰似乎受到邻位效应的促进，这与Atherton等对Trp的研究结果类似；然而，Tyr的烷基化(例如在精氨酸脱保护中)从未作为普遍现象被报道过，这与Trp的情形明显不同(Atherton等，1989，Solid phase synthesisA practicalapproach，《固相合成实践进展》IRLpress，Oxford)。此外，Atherton的研究是仅限于C末端Trp，而以C末端到N末端的方向合成的二价水蛭肽中的Tyr残基，仅是邻末端的(juxtaproximal)，即生长中肽链C本文档来自技高网...

【技术保护点】
如式Ⅰ所示的肽－树脂偶联物，其包含２－氯－三苯甲基手臂，　　　　＊＊＊　　Ⅰ　　　　其中Ａ＝Ｂｏｃ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ（Ｒ２）－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｒ３）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（Ｒ４）－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（Ｒ５）－Ｇｌｕ（Ｒ６）－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ（Ｒ７）－Ｇｌｕ（Ｒ８）－Ｔｙｒ（Ｒ９）－Ｌｅｕ－Ｏ－或Ａ＝Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ（Ｒ２）－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｒ３）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（Ｒ４）－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（Ｒ５）－Ｇｌｕ（Ｒ６）－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ（Ｒ７）－Ｇｌｕ（Ｒ８）－Ｔｙｒ（Ｒ９）－Ｌｅｕ－Ｏ－或Ａ＝ＮＨ↓［２］－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ（Ｒ２）－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｒ３）－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（Ｒ４）－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（Ｒ５）－Ｇｌｕ（Ｒ６）－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ（Ｒ７）－Ｇｌｕ（Ｒ８）－Ｔｙｒ（Ｒ９）－Ｌｅｕ－Ｏ－，且其中Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９是氨基侧链保护基，Ｒ１是不溶性固相。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AS德罗兹，J施尼德里格，N施图德，S瓦雷，C温格，O韦尔比茨基，
申请(专利权)人：隆萨股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]