一种DNA分子的定点编辑方法技术

本发明专利技术一种DNA分子的定点编辑方法，采用静电场电荷相互作用，载玻片作为调控装置的中间介质，铜胶带作为装置电极板，并在上下两表面分别引出一条导线用于与直流电源相连；DNA分子溶液用TE缓冲液稀释至一定浓度作为实验DNA溶液，采用新鲜剥离的氟晶云母片作为基底，将氟晶云母片置于电场调控装置上极板的中间位置，将配置好的DNA溶液滴到云母片上，然后采用电压增进式对装置进行充电，将每个电压值下拉伸的DNA分子样品置于AFM系统下成像，直至在云母片上得到具有拉直的并且分散有序的DNA分子图像，随后选择单根DNA分子并分别采用恒力切割和酶切割两种方法对DNA分子进行定点切割。本发明专利技术具有良好的稳定性；采用恒力和酶切割，方法简便快捷，碱基针对性强，效率高。

Fixed point editing method for DNA molecule

The invention relates to a method for fixed-point editing of DNA molecules by electrostatic field, electrostatic interaction, slides as medium control device, copper tape device as the electrode plate, and on the two surface respectively leads to a wire connected to DC power supply; DNA molecular solution diluted with TE buffer to a certain concentration as experiment DNA solution, Fluorphlogopite Mica Sheet with fresh peel as the substrate, the middle plate of Fluorphlogopite Mica Sheet is arranged on the electric control device, dropping solution DNA configured to mica, and then the voltage type charging device to increase, each voltage value of DNA molecules under tensile samples were placed in the AFM system the imaging, until on mica and dispersed DNA molecular image orderly has straightened, then choose a single DNA molecule were used for constant cutting and cutting enzyme two A method for site directed cleavage of DNA molecules. The invention has good stability, adopts constant force and enzyme cutting, has the advantages of simple and convenient method, strong base pertinence and high efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种DNA分子的定点编辑方法
本专利技术涉及一种采用电场调节装置和AFM系统实现DNA分子拉伸、拉直及定点切割的方法，属于生物大分子纳米操纵

技术介绍
自20世纪后期以来，随着科学技术的长足进步与发展，对于自然的探索，人类开始由对外界的认知转向其自身转变，生命科学受到人们越来越多的关注并占据着举足轻重的地位。与此同时，生命科学领域内取得了卓越的进步与发展：DNA分子双螺旋结构的发现与研究、克隆技术的突破、转基因技术的成功、基因重组及嫁接技术的探索等。生命科学与我们的生活息息相关，并很大程度上促进了工业、农业、环境保护以及医学等领域的发展。以人类基因组计划为代表，全球范围内对此投入了越来越多的人力、物力和财力。步入21世纪，生命科学的研究已经开始向单细胞单分子层次发展。目前，许多科技工作者已经从生物单分子范畴着力对生命活动的过程、疾病的治疗以及药物作用机理等进行研究与探索。在生物大分子中，DNA分子因包含有生物的遗传信息而备受关注，成为生物分子学中的重要研究对象。自1953年DNA分子的双螺旋构造被提出以来，它的种种性质一直都是各领域科研人员的重点研究目标。由于DNA分子在大多数情况下都是卷曲状态，并且是无规则的，因此宏观或微观条件下都很难观察其细微结构，同时，每条DNA分子链上碱基对的数目也会有许多差异，排列次序也呈现多样化，从而表现出的遗传信息会有所不同。伴随着纳米电子学、材料科学、生物医学及生物分子学的迅速发展，我们可以采用新的技术工具来分析DNA分子的序列信息，从而实现对DNA分子序列进行定点编辑的目的，完成对生命活动信息的监测等。采用机器人纳米操纵技术对DNA分子进行研究，除了有利于对单分子序列信息的探索，还可以通过特定力的拉伸来探究DNA分子折叠结构力学及基因编辑等信息。总之，采用微纳操纵技术来完成对DNA分子的操纵，对于在纳米层次上直接探究生物分子的作用、展现各类重要生命活动的本质、完成DNA分子编辑、促进新型特性化医疗器械的研发和各种疾病的治疗等都具有重大而深远的意义。目前，用于DNA分子的定点编辑方法通常都是采用生物学基因打靶技术实现，容易引入额外的突变基因，且编辑效率比较低。本专利技术克服了这一缺点，精准定位基因位点，将DNA分子拉伸，避免了DNA分子链上其它位点的干扰，针对性强，操作过程简便。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种电场力操纵DNA分子实现其拉伸、拉直及定点切割的方法。本专利技术采用直流电源通过电压增进式给装置充电，利用电场力拉伸DNA分子，通过AFM系统检测DNA分子的拉伸情况，选择单个DNA分子为待操纵目标，采用恒力和酶切割两种方式实现DNA分子的定点切割。本专利技术属于生物大分子纳米操纵
，提供了一种低成本、简洁、高效的DNA操纵技术方法。本专利技术方法通过如下技术方案实现：采用静电场电荷相互作用，载玻片作为调控装置的中间介质，铜胶带作为装置电极板，并在装置上下两表面分别引出一条导线用于与直流电源相连；DNA分子溶液用TE缓冲液稀释至一定浓度作为实验DNA溶液，采用新鲜剥离的氟晶云母片作为基底，将氟晶云母片置于电场调控装置上极板的中间位置，设定所需电压值至装置充电完成，将配置好的DNA溶液滴到云母片上。然后采用电压增进式对装置进行充电，将每个电压值下拉伸的DNA分子样品置于原子力显微镜(AFM)系统下成像，直至在云母片上得到具有拉直的并且分散有序的DNA分子图像，随后选择单根DNA分子并分别采用恒力切割和酶切割两种方法对DNA分子进行定点切割。本专利技术利用DNA分子具有微弱负电性的特性，与调控装置表面的正电荷具有异性相吸的作用来操纵DNA分子，使其呈现出有序的平行序列。恒力切割是通过对AFM系统针尖施加一定大小的力，并让其划过DNA分子的特定碱基来实现DNA分子的定点切割；采用酶切割是利用限制性内切酶在Mg2+存在的条件下可以剪切DNA分子任意位点这一性质，将带有酶溶液的针尖置于准备切割的位点，完成定点切割。在DNA分子拉直过程中应用静电场的作用，设备简单，过程简洁快速，制备成本低，DNA分子无需钝化处理过程，不使用有毒化学溶剂，所制备的DNA分子平行序列重现性好，易于切割，并且具有良好的稳定性；切割过程中，采用恒力和酶切割，方法简便快捷，碱基针对性强，效率高。如图1所示，本专利技术具体包括以下步骤：(1)DNA分子溶液的配置：取1.0～2.0μL的原浓度为0.25～0.6μg/μL的DNA分子溶液，48.0～49.0μL的TE缓冲液，将两溶液混合，置于离心管中采用振荡器振荡，得到稀释均匀的DNA分子溶液，密封待用；(2)密封待用；第二步，云母衬底预处理：将云母衬底分别用去离子水、无水乙醇超声清洗60～120s(超声频率为42000Hz)，取出后自然干燥；用透明胶带剥离云母衬底，得到完整的一层，密封待用；(3)电场调控装置的制作：将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.1mm～0.3mm的载玻片作为调控装置的电介质，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥；将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.01～0.05mm的导电金属片平铺覆盖于载玻片的上、下两个表面作为电场调控装置的上、下两极板，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥，制成电场调控装置；(4)拉直：将步骤(3)中所制得的调控装置的上、下两极板通过导线分别与直流电源的正、负极相连，将步骤(2)剥离后的云母衬底置于调控装置的中间位置，调节电源电压值使其由0V～0.2V以0.025V为间隔依次增加，待装置充电完成，将步骤(1)中稀释均匀的DNA分子溶液分别滴至不同电压值下的云母衬底表面，得到DNA分子样品；(5)成像：将DNA分子样品置于AFM系统样品台上，系统设置为Imaging工作模式，设置各扫描参数，LineRate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，成像，得到DNA分子扫描图像。(6)定点切割：在步骤(5)中得到的DNA分子扫描图像中选择一根单独被拉伸的DNA分子作为切割目标，然后采用恒力定点切割或酶定点切割方法对目标DNA分子进行定点切割，最终完成DNA分的定点编辑。如图2所示，恒力切割过程：(1)将AFM系统的Imaging模式切换成Manipulation模式，选取目标DNA分子的待切割位点，规划切割路径；(2)精确定位探针及DNA分子的相对位置，针尖下移，设置各切割参数值，V：0.5μm/s；Setpoint：1.0～1.5V；IGain：150Hz；PGain：0.0048，通过纳米位移平台控制探针的移动，按步骤(1)中规划的路径对DNA分子进行定点切割，切割完毕抬针；(3)将AFM系统的Manipulation模式重新切换成Imaging模式，在该模式下，下针，设置各扫描参数，LineRate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，重新扫描该区域，根据扫描图像判断是否成功实现DNA分子的定点切割；(4)如若没有成功，则继续从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子的定点编辑方法，其特征在于：采用电场调控装置操纵DNA分子使其由凌乱无序状态拉伸为平行有序序列，然后通过AFM系统完成DNA分子的定点切割，具体步骤如下：第一步，DNA分子溶液的配置：取1.0～2.0μL的原浓度为0.25～0.6μg/μL的DNA分子溶液，48.0～49.0μL的TE缓冲液，将两溶液混合，置于离心管中采用振荡器振荡，得到稀释均匀的DNA分子溶液，密封待用；第二步，云母衬底预处理：将云母衬底分别用去离子水、无水乙醇超声清洗60～120s，取出后自然干燥；用透明胶带剥离云母衬底，得到完整的一层，密封待用；第三步，电场调控装置的制作：将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.1mm～0.3mm的载玻片作为调控装置的电介质，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥；将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.01～0.05mm的导电金属片平铺覆盖于载玻片的上、下两个表面作为电场调控装置的上、下两极板，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥，制成电场调控装置；第四步，拉直：将第三步中的电场调控装置通过导线与直流电源相连，将第二步中剥离后的云母衬底置于装置的中间位置，调节电源电压，待装置充电完成，将第一步中稀释均匀的DNA分子溶液滴到不同电压值下的云母衬底表面；第五步，成像：将DNA分子样品置于AFM系统样品台上，AFN系统设置为成像Imaging工作模式，扫描成像，得到DNA分子扫描图像；第六步，定点切割：在第五步中的DNA分子扫描图像中选择一根单独被拉伸的DNA分子作为切割目标，然后采用恒力定点切割或酶定点切割方法对目标DNA分子进行定点切割，最终完成DNA分的定点编辑。...

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子的定点编辑方法，其特征在于：采用电场调控装置操纵DNA分子使其由凌乱无序状态拉伸为平行有序序列，然后通过AFM系统完成DNA分子的定点切割，具体步骤如下：第一步，DNA分子溶液的配置：取1.0～2.0μL的原浓度为0.25～0.6μg/μL的DNA分子溶液，48.0～49.0μL的TE缓冲液，将两溶液混合，置于离心管中采用振荡器振荡，得到稀释均匀的DNA分子溶液，密封待用；第二步，云母衬底预处理：将云母衬底分别用去离子水、无水乙醇超声清洗60～120s，取出后自然干燥；用透明胶带剥离云母衬底，得到完整的一层，密封待用；第三步，电场调控装置的制作：将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.1mm～0.3mm的载玻片作为调控装置的电介质，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥；将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.01～0.05mm的导电金属片平铺覆盖于载玻片的上、下两个表面作为电场调控装置的上、下两极板，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥，制成电场调控装置；第四步，拉直：将第三步中的电场调控装置通过导线与直流电源相连，将第二步中剥离后的云母衬底置于装置的中间位置，调节电源电压，待装置充电完成，将第一步中稀释均匀的DNA分子溶液滴到不同电压值下的云母衬底表面；第五步，成像：将DNA分子样品置于AFM系统样品台上，AFN系统设置为成像Imaging工作模式，扫描成像，得到DNA分子扫描图像；第六步，定点切割：在第五步中的DNA分子扫描图像中选择一根单独被拉伸的DNA分子作为切割目标，然后采用恒力定点切割或酶定点切割方法对目标DNA分子进行定点切割，最终完成DNA分的定点编辑。2.根据权利要求1所述的DNA分子的定点编辑方法，其特征在于：所述第六步中的恒力定点切割方法，包括以下具体步骤：(1)将AFM系统的Imaging模式切换成Manipulation模式，选取目标DNA分子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭芬芬，王作斌，王非非，王莹，刘劲芸，王馨悦，黄婷婷，董莉彤，宋正勋，翁占坤，许红梅，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22