本发明专利技术涉及聚乙二醇（ＰＥＧ）修饰的抗菌／中和内毒素变构肽ＢＮＥＰ分子、其合成方法及其医学用途。本发明专利技术采用多肽固相合成法、多肽液相合成法以及这两种方法的组合，将抗菌／中和内毒素变构肽ＢＮＥＰ以具有安全无毒、免疫原性极低、可以延长药物血浆半衰期等优异特性的ＰＥＧ修饰，合成了一类ａｍＰＥＧ修饰的ＢＮＥＰ衍生物：Ｙ－ＢＮＥＰ－Ｚ－ａｍＰＥＧ生物活性检测表明，该衍生物不仅保留了ＢＮＥＰ的中和内毒素活性，而且延长了ＢＮＥＰ的体内半衰期，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力，为由革兰阴性杆菌（Ｇ－）引起的全身性炎症反应综合征、脓毒症和脓毒性休克等危重患者的治疗提供新的治疗药物或方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类用以治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克等疾病或症状的高分 子修饰的多肽分子、其制备方法和医学用途。
技术介绍
脓毒症(sepsis)是感染所致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),进一步发展可导致严重感染、脓毒性休克(septic shock)及 多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfUnction syndrome, MODS)。 美国疾病控制 中心的统计调查结果显示: 美国每年大约有75万人感染脓毒症，超过21万人因此而丧生全身性感染已成为美 国老年人十大死因之一，每年投入全身性感染的医疗费用高达l亿美元。在中国，多 发伤、严重创伤、外科大手术后全身性感染、严重感染、MODS的患病率及死亡率较 国外报道略高。虽然国内外临床上广泛采用了综合疗法，但其死亡率仍居高不下，脓 毒症仍是导致危重病人死亡的第一因素。革兰阴性菌细胞外膜内含有脂多糖(LPS),也称内毒素，当它释放入血后可引起 宿主的炎症瀑布效应并导致内毒素血症甚至死亡。目前普遍认为，内毒素是介导G-菌脓毒症的重要启动子，通过其调节蛋白或结合受体的作用，诱导宿主多种细胞因子 的释放，激发机体一系列病理生理改变。国内外针对G-细菌感染所伴随的内毒素血 症的防治研究已进行了数十年，但目前尚无一种安全有效的特异性中和LPS的制剂。杀菌性/通透性增力口蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)是一个分 子量介于50-60 kD之间的阳性蛋白。大量动物实验证实，BPI具有强大的杀灭G-细 菌及中和LPS活性，被国外学者誉为"超级抗生素"。1992年获得BPI重组功能性的 iV-末端1 199个氨基酸片段(rBPl23)。临床研究表明，rBPl23及其突变体rBPI^兼有杀 菌、中和内毒素作用，与内毒素具有很高的亲和力；rBPl2!与抗菌素合用，效应增强； rBPl2i发生生物效应时，对机体不产生任何损害。因此rBPIu存在着广阔的应用前景， 最有希望成为特异性中和LPS的药物。但 是rBPIn易于被肝脏降解或从肾脏排泄，生物半衰期不足l小时，存在生产成本高、 绝对用量大、难以广泛应用于临床等问题。 PEG具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织 液中，能被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用，是一种安全无毒的聚合物，得 到了美国食品与药物管理局(FDA)的认可。此外，PEG具有良好的水溶性，也能溶 于二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、 二曱基曱酰胺(DMF)等有机溶剂，有利于修饰反应 的进行和产物的分离纯化。更难得的是，PEG通过共价联结至多肽分子上进行化学修 饰，即聚乙二醇化(PEGylation)，不仅它的许多优良性质随之转移到结合物中，而且 可改变多肽分子某些生物化学特性，包括分子大小、疏水性及电荷等，增加多肽分子 水溶性和稳定性。已有大量事实证明，PEG化蛋白既能保留天然蛋白质的生物学活性， 也能有效地克服蛋白质类药物在临床应用中的一些缺点，如可以延长血浆半衰期、增 强生物利用度、提高药物疗效及安全性等。利用PEG化技术来进行蛋白药物的二次开发正成为新药开发的热点。本专利技术仍然选取中国授权专利01104591.4中的BNEP9901315作为母体分子 (BNEP)，对其碳端进行PEG修饰，合成了一类BNEP的amPEG偶联物；通过多浓 度鲎试验、生物传感器亲和力试验、细胞因子刺激试验、体外抗菌试验，获得了具有 较理想中和内毒素活性的BNEP多肽的amPEG偶联物，显示了进一步开发成为新型 中和内毒素药物的潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一类治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克等疾病或 症状的高分子修^饰的多肽分子(见下)。本专利技术的另 一个目的在于提供合成上述多肽BNEP的amPEG偶联物分子及其氮 端衍生物的方法。本专利技术的再一个目的在于提供上述多肽BNEP的amPEG偶联物分子及其氮端衍 生物的医学用途。本专利技术选取中国授权专利01104591.4设计的BNEP 9901315: iOXGG『丄/g丄 FZ/ii:A:作为母体分子(BNEP)，对其碳端进行amPEG修饰，并采用多肽固相合成法、 多肽液相合成法以及这两种方法的组合，合成具有下列通式的amPEG修饰的母体分 子及其^f汁生物Y-BNEP誦Z彌PEG其中，Y是氢或其它修饰基团，包括但不限于酰基、Cl-C18烷基、芳基千基、 烯丙基；Z是各种连接基，包括但不限于-NH(CH2)nCO-(『l-8)、 -NH(CH2)nX (n=l-10, X=0，S， NH,etc),也可以没有连接基；amPEG的分子量包括但不限于2000， 4000， 6000, 12000和20000。采用多肽可溶性聚合物液相合成法，逐步偶联合成得到全保护的[B證I--Z-amPEG后(逐步合成法)，又采用固相合成法得到全保护的BNEP肽树脂，去除碳 端树脂、与预先合成的Z-amPEG液相偶联(片段合成法)，又得到了纯度更高的 BNE外Z-amPEG，裂解后得到目标分子之一 BNEP-Z-amPEG。通过类似方法，合成了 中国专利申请94191894中的BPI.13 (SEQ ID No: 15 /CSi^G『丄/g丄F/^iQ与 amPEG的偶联物BPI-Z-amPEG,作为活性研究的对照物之一。必要时，合成上述分 子的氮端衍生物。 一般采用高效液相色谱法(HPLC)确定纯度，基质辅助激光解吸释间 飞行质谱(MALDI-TOFMS)测定分子量，氨基酸组成测定进一步确定结构。上述BNEP-Z-amPEG偶联物分子可以表现为多肽的药学上可接受的各种无机酸、 有机酸的盐类，诸如三氟醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐和氨基酸盐等。再一方面，本专利技术涉及联合制剂，该联合制剂包括一种中和内毒素功能多肽的 amPEG偶联物，或其药物学上可接受的盐，和一种在药物学上可接受的载体或赋形 剂。本专利技术的BNEP-amPEG偶联物的制备方法1、母体肽树脂Fmoc扭NE外CTC合成通法称取适量Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂或其它多肽合成M酸树脂倒入合成柱中，加 入溶剂(DCM, DMF, orDCM/DMF)溶胀，以10%-50%六氢吡啶的DMF溶液脱除氨 基酸树脂的Fmoc保护基团，4企测后抽滤至干，用DCM、 MeOH、 DMF、 DCM、 DMF 依次洗涤，除尽六氢吡啶。称取本专利技术的抗菌/中和内毒素变构肽BNEP的^J^^ 列C端第二个氨基酸Fmoc- Lys(Boc)-OH于适宜的容器中，加入适量DMF溶解，然 后加入偶联剂(如TBTU/HOBt， HBTU/HOBt， HATU/HOAt, DIC/HOBt, DCC/HOBt， DCC/HOSu， TBTU/HOSu, PyBOP/HOBt， BOP/HOBt, "c)和适量氮曱基吗啉或二 异丙基乙胺的DMF溶液。偶联完成后，除去反应液，以DCM、 MeOH、 DMF、 DCM、 DMF依次洗涤肽树脂；加入20%-50%六氩吡咬的DMF溶液脱除本文档来自技高网...
【技术保护点】
聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：具有下列结构通式， Ｙ－ＢＮＥＰ－Ｚ－ａｍＰＥＧ 其中，Ｙ是氢或其它修饰基团，包括但不限于酰基、Ｃ１－Ｃ１８烷基、芳基苄基、烯丙基；Ｚ是各种连接基，包括但不限于－ＮＨ（ＣＨ↓［２］）ｎＣＯ－（ｎ＝１－８）、－ＮＨ（ＣＨ↓［２］）ｎＸ（ｎ＝１－１０，Ｘ＝Ｏ，Ｓ，ＮＨ，ｅｔｃ），或者没有连接基；ａｍＰＥＧ的分子量包括但不限于２０００，４０００，６０００，１２０００或２００００。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨大成，范莉，徐宏，郭毅斌，刘红萍，李同金，李长兵，夏培元，顾敬松，肖光夏，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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