以四唑为功能基的多用途分离介质及其制备方法技术

本发明专利技术公开了以四唑为功能基的多用途分离介质及其制备方法。具体地说是用化学方法将四唑键合在硅胶、葡聚糖和琼脂糖凝胶分离基质表面，制备了一种结构新颖的分离介质。本发明专利技术具有在离子交换色谱和金属螯合色谱中应用的双重用途；该介质用于蛋白质的离子交换分离，蛋白质的分离择性高、易再生、分离速度快，蛋白质量和活性回收率高；该介质用于蛋白质的金属螯合色谱，蛋白质的分离择性高，金属离子流失小，分离速度快，蛋白质量和活性回收率高；本发明专利技术可在基因工程产品及血浆蛋白的快速分离纯化中获得应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于色谱分离
，具体涉及以四唑为功能基的多用途分离 介质及其制备方法。
技术介绍
色谱分离技术是生物工程领域内生物大分子分离的常用方法之一。在该方法中，分离介质是整个分离技术中的关键材料，其消耗占生产成本的50% 左右。.目前，用于生物大分子色谱分离的模式主要有反相色谱、疏水相互作 用色谱、离子交换色谱、亲和色谱(包括金属螯合色谱)和排阻色谱。离子 交换色谱(IEC)是其中最为常用的方法。众所周知，根据固定相上离子交换 基团的带电性质，IEC固定相可分为阳离子交换和阴离子交换色谱固定相；根 据交换基团的解离程度，又分为强阳/强阴离子和弱阳/弱阴离子交换色谱固定 相。目前，弱阳离子交换固定相上的交换基团包括羧基和磷酸基。蛋白质在 该类固定相上的保留不仅取决于其表面带电荷的性质和数量，而且与固定相 上羧基或磷酸基的解离程度有关。所以，在建立蛋白质的分离条件时，可以 选择合适的pH值使蛋白质获得选择性分离。但是，随着蛋白质组学、代谢组 学和基因工程的发展，现有固定相因选择性差，不能满足复杂生物样品分离 的需要。因此，发展特殊性他的功能分离介质依然是色谱研究中面临的挑战。金属螯合色谱是依靠周定相上的配体与过渡金属离子螯合，然后蛋白质 再与金属离子螯合，根据螯合作用力的强弱对生物大分子进行选择性分离的 方法，在血清蛋白分离中有广泛应用。在该方法中，影响分离选择性地因素 主要有配体结构,金属离子种类和色谱流动相组成。目前，固定相上的配 体种类主要有(i)二齿配体，如水扬醛(salicylaldehyde),氨羟基酰胺酸(aminohydroxamic acid)或8-羟基喹啉(8勿droxy-quinoline); (ii)三齿酉己体, 如o-嫌酸丝氨酸(wAo-phosphoserine)，吡P定二胺(dipicolylamine), 或frara-羧基-甲基脯氨酸(c/s画 or fra"s-carboxy-methylproline)， 氨基二乙酸 (Iminodiacetic acid)和N- (2國吡甲基)氨基乙酸(N- (2-pyridylmethyl) aminiacetate); (iii)四齿酉己体,如氨三乙酸(N- (2-pyridylmethyl) aminiacetate );和(iv) 五齿配体，如 Agvgv-三-(羧甲基)乙烯二胺(iV，A^/V-tris-(carboxy-methyl)ethylenediamine )。 这些配体与金属结合的强度 和对蛋白质的选择性各异。同时，这些配体依然存在着金属离子流失的风险， 而且用途单一。
技术实现思路
本专利技术的目,.的之一是提供一种使用寿命长、易于再生的新型多用途色谱 分离介质，该分离介质既可以作为离子交换分离介质使用，也可以作为金属 螯合色谱分离介质使用。本专利技术的另一目的是提供上述多用途色谱分离介质的制备方法。本专利技术的实现过程如下.以四唑为功能基的多用途分离介质，具有如下结构通式^^OCH2-CH-CH2-R"！ \^WN'R2代表硅胶、琼脂糖或葡聚糖；R,为O或NH; 112为H、 Cr C4 的烷基、苯基或苄基。上述多用途分离介质的制备方法硅胶与？缩水甘油醚氧丙基三乙氧基 硅烷反应，合成表面键合环氧基的硅胶，然后与a-氨基四唑或ot-羟基四唑在 碱或三氟化硼乙醚催化剂作用下反应即得四唑多用途分离介质；所述的a-氨基四唑结构如下<formula>formula see original document page 6</formula>R2R2为H、 d-C4的烷基、苯基或节基; 所述的a-羟基四唑结构如下<formula>formula see original document page 6</formula>R2R2为H、 d-C4的烷基、苯基或节基。 葡聚糖或琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖 或琼脂糖凝胶，然后与a-氨基四唑或a-羟基四唑在碱或三氟化硼乙醚催化作 用下反应即得四唑多用途分离介质； 所述的a-氨基四唑结构如下硅胶与Y-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷反应，合成表面键合环氧基的 硅胶，然后在三氟化硼乙醚催化下与a-羟基腈反应，在键合a-羟基腈的硅胶 中，加入DMF、 NaN3和NH4Cl反应即得四唑多用途分离介质。葡聚糖或琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖 或琼脂糖凝胶，然后在三氟化硼乙醚催化下与oc-羟基腈反应，在键合a-羟基 腈的葡聚糖或琼脂糖凝胶中，加入DMF、 NaN3和NH4Cl反应即得四唑多用 途分离介质。本专利技术用化学方法将四唑键合在硅胶、葡聚糖和琼脂糖凝胶分离基质表 面，制备了一种结构新颖的分离介质，当该介质未螯合金属离子时可以作为 离子交换分离介质使用，若螯合上金属离子后又可以作为金属螯合色谱分离 介质使用。本专利技术的优点与积极效果(1) 本专利技术多用途分离介质具有在离子交换色谱和金属螯合色谱上应用的双重功能；(2) 本专利技术多用途分离介质用于蛋白质的离子交换分离，蛋白质的选分离 择性高、蛋白质量和活性回收率高；用于蛋白质的金属螯合色谱，蛋白质的 选分离择性高，金属离子流失小，分离速度快，白质量和活性回收率髙。在 室温下，溶菌酶的活性回收率>95%。肌红蛋白、核糖核酸、cx-糜蛋白酶原-A、 细胞色素-<:和溶菌酶的质量回收率>95%。螯合上Ci^+,连续使用2天，Cu2+ 离子的螯合量损失小于5%。该多用途分离介质可广泛应用于蛋白、酶和生物 工程产品的分离纯化。(3) 本专利技术多用途分离介质使用寿命长。硅胶介质在pJ^2.0-8.0情况下、 葡聚糖介质在pH=1.0-12.0情况下使用1000小时，经清洗后，分离性能未见 改变。U)本专利技术多用途分离介质很容易再生，只要用IO倍体积lmol/L氯化钠 洗涤剂可再生使用，不象一些商品柱要在每次进样后用氢氧化钠再生。(5 )生物工程产品的尿素提取也可以直接上样， 一步分离达到了较高纯度。附图说明图1为蛋白质在oc-氨基苯丙四唑填料(硅胶基质)上的离子交换色谱分 离图。图2为蛋白质在a-羟基苯乙四唑填料(硅胶基质)上的离子交换色谱分 离图。图3为蛋白在Z^+螯合的ot-氨基苯丙四唑填料(硅胶基质)上的金属螯 合色谱4为蛋白在Zi^+螯合的a-羟基苯乙四唑填料(硅胶基质)上的金属螯 合色谱图'图5为基因工程产品重组人干扰素i的8mol/L脲提取液分离图具体实施方式合成多用途四唑固定相所用的主要原料大孔硅胶(7pm,孔径30nm)、 交联琼脂糖凝胶(西安交大保赛生物技术股份有限公司)、交联葡聚糖凝胶(上 海君创生物科技精细化工产品)，Y-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷，2-羟基 丙腈，羟基乙腈，a-羟基苯乙腈，叠氮化钠和环氧氯丙垸为巿售商品。使用的a-氨基四唑和a-羟基四唑按下述方法制备(1 ) a-氨基四唑的制备(R2可选择CH2CH(CH3)2，CH(CH3)2,CH3，C6H5， CH(CH3)CH2CH3或CH2C6H5)FmocHN 、 RN''N、,NH N-，、NH '^=N' 30%三乙胺的甲醇溶液 H2N\^^~~M'R2本文档来自技高网...

【技术保护点】
以四唑为功能基的多用途分离介质，具有如下结构通式：＊＊＊＊代表硅胶、琼脂糖或葡聚糖；Ｒ↓［１］为Ｏ或ＮＨ；Ｒ↓［２］为Ｈ、Ｃ↓［１］－Ｃ↓［４］的烷基、苯基或苄基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卫引茂，雷根虎，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]