抗体多肽文库筛选和选择的抗体多肽类制造技术

本发明专利技术提供了在抗体多肽文库筛选征的进一步动态。本发明专利技术还提供了可通过本发明专利技术方法获得的新分离的抗体多肽类。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体多肽文库筛选和选择的抗体多肽类本专利技术进一步提供了筛选抗体多肽文库中的动态。本专利技术还提供 了可提供本专利技术方法获得的新的分离的抗体多肽类。指定为本申请人的WO99/20749中描述了使用一般配体，例如抗 体或抗体片段或包含来自抗体的 一 种或多种特异性结合位点的任意物 质筛选抗体文库(例如抗体重链可变域文库)的方法。将"抗体"定义为使 用这类抗体的结合(可变)区的构建。将WO99/20749披露的内容引入本 文作为参考，特别是文库生成("本专利技术文库的构建")，从文库中选择多 肽类("本专利技术多肽类的选择")，配体选择("用作多肽选择中的配体的抗 体")和工业化应用("按照本专利技术选择的多肽类的应用")中披露的内容。 明确地将所有这些部分引入本申请以便提供可用于本专利技术的特征的披 露，并且本领域技术人员易于认识到-在本申请权利要求的上下文中-那些可以用于本专利技术的特征。文献中已经描述了非常规抗体类型-重链抗体。已经在具有重链疾 病的患者，EBV转化的B-细胞的血清，且更重要的是在骆驼科 (Camelidae)(骆驼，美洲驼羊)的血清中发现了这些高滴度的抗体。 这些重链抗体不含重链，但仅含单一对的相同重链。这些重链与常用 的IgGs的中的那些不同之处在于它们缺乏在介导重链上轻链配对中起 作用的恒定域l(CHl)。因此，所得重链抗体不含轻链可变域，而仅含 两个未配对的重链可变域。有关免疫接种骆驼科血清的研究已经证实， 尽管不存在轻链，但是这些重链抗体确实特异性结合具有中度到高度 亲和力的抗原。未配对的重链可变域(称作VHH)在进化的自始至终进 行了遗传适应许多氨基酸取代在通常与VL结构域发生相互作用的部 分中发生(甚至在种系水平上)在VHs中保守的L45被Arg取代。其 它位置通常发生突变V37突变成Phe, G44突变成Glu且W47突变 成Gly。最终，来自骆驼(但不限于美洲驼羊)的VHHs的CDR3平均而 言比鼠和人VHS的那些(分别为9和12个氨基酸)长(16-17个氨基酸)， 由此补偿了不存在的VL结构域以便结合抗原。参照WO05044858Al， WO04062551A2, WO04041867A2, WO04041865A2, WO04041863A2, WO04041862A2, WO03050531A2和EP0656946中有关Camelid VHH结构域的描述。自从1989以来，已经认识到抗体的单一可变域具有治疗潜能。由 于其小尺寸，所以它们停靠在难以接近的常规抗体的抗原部位上(裂， 峡谷，活性位点)。这些结构域还可以形成根据需要制成的一定范围的 产物例如可以使它们多聚化(通过化学或遗传方式)以便增加亲和力， 同时保持相对小的总体尺寸。可以通过聚乙二醇化(以便增加流体大小) 或通过与血清蛋白质，诸如展示出延长半衰期(在人体内达19天)的血清清蛋白共价或非共价结合调节血清中的持久性。最终，可以使单一 可变域重新形成IgG以便得益于Fc-效应子功能。在所有情况中，有权 使用的抗原特异性抗体可变域的遗传信息为对所有上述提及的策略而 言绝对必须具备的条件。已经研发了几种方法来分离编码抗原-特异性抗体的抗体可变域的 基因。这些方法之一基于早期的观察结果，即在其研发过程中，B-淋 巴细胞各自表达其细胞表面上单一类型的抗体(由与膜锚定肽的遗传融 合体介导结合)。结合抗原(和T辅助细胞参与)介导B-淋巴细胞的抗原-特异性增殖，在随后阶段发育成熟为血浆细胞。这些细胞不表达表面-结合的抗体，而是大量分泌它们。因此，在其发育过程中，可以将B-淋巴细胞视为遗传展示包装，其中表型(抗体)与基因型连接(抗体基因)。 因此，为了分离编码抗原-特异性抗体的基因，已经研发了方法，其中 (i)使B-淋巴细胞采集物(分离自免疫接种的动物)接触抗原(可以在细 胞或固相上免疫接种或可以用染料标记)；(ii)抗原-特异性B-淋巴细胞 结合抗原；(iii)从未结合的B-淋巴细胞中分离结合的抗原-特异性B-淋巴细胞；(iv)将结合的抗原-特异性B-淋巴细胞回收入贮器。试管， 孔或平亚；和(v)从分离的B-淋巴细胞中回收编码抗原-特异性抗体可 变域的基因(可以作为单克隆或多克隆群体储存)。使用该方案的方法的 实例为下列文献中描述的那些(i) Babcook等(1996)爿cad OSL4 93， 7843-7848。 SLAM通过能够从任意种类中分离在体内免疫应答过程中生成 的高亲和力抗体克服了杂交瘤技术和细菌表达的抗体文库的局限。 SLAM能够使单一淋巴细胞产生具有所需特异性或功能的抗体以便在 淋巴样细胞大群体和编码从该淋巴细胞中恢复的抗体特异性的遗传信 息内得以鉴定，例如能够将所述遗传信息克隆入表达载体，以便能够表达大量的抗体。在一个实施方案中，产生抗体的细胞结合选择的抗原并且使用适合的溶血菌斑试马t法检测(Jerne和Nordin(1963) Sc/ewce 140， 405)。在该试-睑中，使用选择的抗原包^皮红细胞并且将其与产生 抗体的细胞群和补体源 一起孵育。根据溶血菌噬菌斑的形成鉴定产生 单一抗体的细胞。使用倒置显微镜鉴定裂解的红细胞噬菌斑，并且使 用显微操作技术取出在噬菌斑的中心上关注的产生单 一抗体的细胞， 然后用于接种包被了 EL4-B5 T细胞的单一孔(提供有活力的细胞-细胞 相互作用和用于B-细胞表达的可溶性因子)。平均而言，给每个孔接种 0.3 B-细胞以确保克隆分布。然后通过逆转录抗体PCR克隆来自这些克 隆平展的B细胞中的基因。用于检测产生单一抗体的具有所需功能的 细胞的其它方法已经描述在国际专利说明书WO 92/02551中。(ii) de Wildt等(1997)丄/mmw"o/. Me^oA 2073， 61-67。 所述方法包括下列步骤(i)从人供体中采集B-淋巴细胞；(ii)用安装了自动细胞分配部件的荧光活化的流式细胞仪(FACS仪器)检测 CD19+ZCD20+细胞；(iii)将CD19+/CD20+ B细胞各自调配在包被了 EL4-B5 T细胞的单一孔中，所述EL4-B5 T细胞提供细胞-细胞相互作 用(CD40-CD40L)和可溶性生长因子；(iv)使单一 B-细胞各自扩充以便 增加mRNA的量；和(v)通过RT-PCR回收抗体基因。应注意步骤4(B-细胞扩充)为任选的，只要可以将PCR方法设计成可有效地对来自单一 细胞的抗体基因进行PCR扩增。(iii) Lawson等WO 2004106377。在该专利申请中，作者已经通过流式细胞计量术(de Wildt等 (1997)丄/www"o/. M"/ oA, 2073, 61画67)或生物淘选(Lagerkvist等(1995) 肠&c—腦18, 862-869)分离了抗原-特异性B-细胞。与这两种手段 相反，Lawson等的方法无需分离各B细胞。每孔中B细胞的数量在 100 - 20,000的范围-仍然是在B-细胞扩充后，抗体可变基因的RT-PCR 揭示出在大部分孔中的单克隆抗体序列。所有这些方法均使用了抗原来分离呈递抗体的B-细胞亚群。这种 手段未考虑到，在抗原-特异性B-细胞群内，展示的抗体在未直接涉及 抗原结合的区中可本文档来自技高网...

【技术保护点】
从抗体多肽类的所有组成成分中选择功能性可变域群体的方法，所述功能性可变域结合靶配体和一般配体，该一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，但与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤：ａ）使所有组成成分与所述一般配体接触并且选择与之结合的功能性可变域；和ｂ）使选择的功能性可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的可变域群体；其中（ｉ）可变域为重链可变域且一般配体为抗体轻链可变域；或（ｉｉ）可变域为轻链可变域且一般配体为抗体重链可变域；且其中任选在（ｉ）中，重链可变域为Ｃａｍｅｌｉｄ可变域（ＶＨＨ）或来源于Ｃａｍｅｌｉｄ重链抗体（Ｈ２抗体）；或任选在（ｉ）和（ｉｉ）中，可变域各自为人可变域或来源于人。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L耶斯佩斯，J克拉布，
申请(专利权)人：杜门蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]