黄鳝抗菌肽的制备工艺及应用制造技术

本发明专利技术是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特点是，其步骤如下：黏液制备：黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；将黄鳝皮肤黏液制备上清液、干粉，再进行一次筛选，获得４个分离峰；然后再进行二次筛选，筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的ＭＡＳ－Ⅳ；然后对ＭＡＳ－Ⅳ进行三次筛选，筛选得到最终得到目标产物ＭＡＳ－Ⅳ－３、ＭＡＳ－Ⅳ－４黄鳝抗菌肽；ＭＡＳ－Ⅳ－３、ＭＡＳ－Ⅳ－４黄鳝抗菌肽对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从动物中提取抗菌肽的方法，特别是一种黄鳝抗菌肽的 制备工艺。本专利技术还涉及该制备工艺所得产物的用途。
技术介绍
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)， 也称为肽类抗生素(Peptede antibiotics),是抗菌活性短肽的总称，具有抗菌力强、抗菌谱广、活性稳定、 可以中和细菌内毒素、很难产生耐药性等特点。其研究始于在惜古比天蚕蛹 产生的抗菌活性多肽物质既天蚕素(Cecr;^w)，随后人们在动物、植物和微生物中相继发现并分离获得了具有类似性质的活性多肽。水产动物的抗菌肽研究始于1988年，日本学者Nakamura等从亚洲鲎 (rac/i^/ewWW&"tort")用酸提取法纯化出鲎素(rac/^pk^)。后来在贝类、鱼类中均有报到。但黄鳝抗菌肽至今尚未见报到。黄鳝，学名^fo"qpfen^ a/6w，是我国主要经济水产品之一，营养成分 丰富，具有"小暑黄鳝赛人参"之美誉，然而它生存于泥泞污沟却不会发病， 黄鳝养殖中也很少有发病的报到，说明其自身能够产生抵御外源病菌的物质， 故本研究拟探讨从黄鳝中分离纯化抗菌肽的工艺流程，并分离纯化黄鳝抗菌 肽，进而开发利用黄鳝抗菌肽。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、具 有抑菌活性的黄鳝抗菌肽的制备工艺。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。 本专利技术是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特点是，其步骤如下(1) 黏液制备黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中， 撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；(2) 上清液制备将黄鳝皮肤黏液于4 °C、 12000 rpm高速冷冻离心20 min， 取上清液，然后将上清液以厚度不超过2mm分装于若干培养皿中，再 用保鲜膜封盖，-401:冷冻保存备用；(3) 干粉制备取-40。C冷冻保存24 h以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上 扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓縮，获黄鳝皮 肤黏液的干粉；(4) 一次筛选称取干粉5-10 g， 5-10mLPBS缓冲液溶解，-4"离心15 min， 取上清液为样品；测定样品A，；然后选用2.6 cmX100 cm层析柱， Sephadex G-50填料，pH 6.0、 0.1 mol/L PBS洗脱液，按常规方法用 Sephadex G-50装柱后，以6 s—滴的速度平衡柱子24 h，将总OD为 200-300的样品滴加至Sephadex G-50凝胶柱表面，让样品自然或6 s — 滴的速度流入Sephadex G-50凝胶柱中；安装好层析系统，以10 s —滴 的速度洗脱，自动收集器收集，得每管3mL的按序编号的收集管若干; 测定各收集管中A，和A220，以收集管序号为横坐标、A湖和A22o为纵 坐标，制作分离图谱，获得4个分离峰，分别命名为MAS-I、 MAS-II、 MAS-III和MAS-IV;(见图1);(5) 二次筛选采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌(jera"。"ay孙(ira/ m7(3)、禾古草芽孢杆菌(5acz7/us s"6"fc)、 白色念珠 菌(Ca"c/油a/6z'c<ms)、 大肠杆菌(^Esc/zer/c/ /a co//)、 金黄色葡萄球菌 (Sto/ /^/ococcw flwrew力、鳗弧菌(F 6n'o fl"gwz7arww)禾口鲁克氏耳卩尔森菌 reefer);将上述7种菌种制备成A6(M)=0.06的菌悬液，取100 |aL 涂布于LB培养基上，用微量移液器取20 ^L分离液浸润滤纸，将滤纸 片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌， 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV;(6) MAS-IV溶液透析:12000 r/min, 4。C离心MAS-IV 5 min，取出上清液， 放入透析袋(截留分子量3500)中，用Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L， pH7.8)透析2-4h，中间更换缓冲液l-2次；(7) MAS-IV离子交换层析选用12mmX200mm (实装160mm)层析柱， DEAE Sepharose Fast Flow填料，Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利 用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L， pH7.8)进行梯度 洗脱，NaCl浓度从0%-100%，洗脱5个柱体积(108 mL)，流速 l.OOmL/min;根据Biologic Duoflow蛋白质层析系统配套软件显示的分 离峰，分别收集7个分离峰，并依次命名为MAS-IV-1 ， MAS-IV-2， MAS-IV-3 、 MAS-IV-4、 MAS-IV-5、 MAS-IV-6和MAS-IV國7;(8) MAS-IV离子交换层析产物的浓縮将MAS-IV-1， MAS-IV-2， MAS-IV-3 、 MAS-IV-4、 MAS-IV-5、 MAS-IV-6和MAS-IV-7分别分装于培养皿中， 厚度不超过2 mm，并用保鲜膜封盖，置-40 "冰箱冷冻；24 h后取出 培养皿，在封盖保鲜膜上扎孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干 燥浓縮，获各分离峰干粉； (9)三次筛选采用步骤(5)中所述的方法进行再一次的筛选用抑菌实验; 用适量无菌水溶解上述各分离峰干粉制成样品液；筛选得到MAS-IV-3 、 MAS-IV-4对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑 菌活性；最终得到目标产物MAS-IV-3 、 MAS-IV-4黄鳝抗菌肽。本专利技术以黄鳝为研究对象，制备其皮肤黏液，经Sephadex G-50和DEAE Sepharose Fast Flow等生物化学分离纯化技术获得具有抗菌活性的多肽或蛋 白，用抑菌圈法检测抑菌活性。黄鳝皮肤黏液经一次筛选所得到的MAS-I、 MAS-II 、 MAS-III和MAS-IV, 抗菌实验结果结果显示对其中五种菌有抑菌效果。参照图2-6可知MAS-I、 MAS-II、 MAS-III、 MAS-IV都或多或少的对一种或几种菌有抑菌效果。 对MAS- I、 MAS-II、 MAS-III和MAS-IV的抑菌效果进行对比，可以看出 MAS-IV对图中五种菌都有抑菌效果。所以对MAS-IV进一步分离筛选。将 MAS-W经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离结果如图7。共收集7 个峰，命名为MAS-IV-l， MAS-IV-2， MAS-IV-3 、 MAS-IV-4、 MAS-IV曙5、 MAS-IV-6和MAS-IV-7，为简便起见，图中分别标注为1 、 2、 3、 4、 5、 6 、 7 。在本专利技术中，材料黄鳝购自连云港市水产品市场。实验用指示菌嗜水 气单胞菌(爿era"o/my场(iro/ m7a)、枯草芽孢杆菌(5ac/〃ws sw&z7&)、 白色念 珠菌a/6/c<ms)、 大肠杆菌(E^c/zm.c/n.a co//)、 金黄色葡萄球菌)、鳗弧菌(J^n'o朋gw7aram)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特征在于，其步骤如下：　（１）黏液制备：黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；　（２）上清液制备：将黄鳝皮肤黏液于４℃、１２０００ｒｐｍ高速冷冻离心２０ｍｉｎ，取上清液，然后将上清液以厚度不超过２ｍｍ分装于若干培养皿中，再用保鲜膜封盖，－４０℃冷冻保存备用；　（３）干粉制备：取－４０℃冷冻保存２４ｈ以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓缩，获黄鳝皮肤黏液的干粉；　（４）一次筛选：称取干粉５－１０ｇ，５－１０ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液溶解，－４℃离心１５ｍｉｎ，取上清液为样品；测定样品Ａ↓［２８０］；然后选用２．６ｃｍ×１００ｃｍ层析柱，Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０填料，ｐＨ　６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ洗脱液，按常规方法用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０装柱后，以６ｓ一滴的速度平衡柱子２４ｈ，将总ＯＤ为２００－３００的样品滴加至Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０凝胶柱表面，让样品自然或６ｓ一滴的速度流入Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０凝胶柱中；安装好层析系统，以１０ｓ一滴的速度洗脱，自动收集器收集，得每管３ｍＬ的按序编号的收集管若干；测定各收集管中Ａ↓［２８０］和Ａ↓［２２０］，以收集管序号为横坐标、Ａ↓［２８０］和Ａ↓［２２０］为纵坐标，制作分离图谱，获得４个分离峰，分别命名为ＭＡＳ－Ⅰ、ＭＡＳ－Ⅱ、ＭＡＳ－Ⅲ和ＭＡＳ－Ⅳ；　（５）二次筛选：采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和鲁克氏耶尔森菌；将上述７种菌种制备成Ａ↓［６００］＝０．０６的菌悬液，取１００μＬ涂布于ＬＢ培养基上，用微量移液器取２０μＬ分离液浸润滤纸，将滤纸片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的ＭＡＳ－Ⅳ；　（６）ＭＡＳ－Ⅳ溶液透析：１２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心ＭＡＳ－Ⅳ５ｍｉｎ，取出上清液，放入透析袋中，用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　７．８）透析２－４ｈ，中间更换缓冲液１－２次；　（７）ＭＡＳ－Ⅳ离子交换层析：选用１２ｍｍ×２００ｍｍ层析柱，ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ填料，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｄｕｏｆｌｏｗ蛋白质层析系统，利用含０．...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安贤惠，李联泰，浦寅芳，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]