一种免疫抑制药物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属制药领域，具体涉及一种从雷公藤中提取得到单体化合物去甲泽拉木醛，以其为有效成分的免疫抑制药物及其制备方法。本发明专利技术单体化合物去甲泽拉木醛可作为药物原料制成口服缓释制剂、软胶囊、注射剂、软膏剂等。本发明专利技术免疫抑制药物毒性副作用极少、来源广泛、生产成本低，价格便宜、应用方便，本发明专利技术药物用于器官移植后抗排斥反应效果明显，还可用于治疗临床其他自身免疫性疾病如红斑狼疮等。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属制药领域，具体涉及一种以去甲泽拉木醛为有效成分的免疫抑制药物及其制备方法以及由其制剂在器官移植后抗排斥反应及治疗某些自身免疫性疾病的应用。已有研究从植物雷公藤中分离到一种淡黄色结晶物质，其分子量为480，熔点为260℃(分解)，分子式为C29H36O6的酚性去甲基三萜化合物，其英文名称为demethylzeylasteral(简称Dzy，T-96，TZ-93)，定名去甲泽拉木醛。其化学结构式如下所表示 本专利技术药物按下述步骤进行制备1.原料药去甲泽拉木醛的提取工艺过程包括雷公藤原料的干燥、粉碎、有机溶剂的提取，有机溶剂的回收，用硅胶分离，单体化合物的鉴定。其特征是将经干燥并粉碎药材，置回流锅内，加入1-3倍的乙酸乙酯，加热回流3小时，重复2次，得乙酸乙酯提取液，回收溶媒，得干浸膏，得率为8.25％，取浸膏5-10倍量的硅胶进行柱层析，采用正己烷/丙酮梯度洗脱，得到去甲泽拉木醛淡黄色结晶物质。2.去甲泽拉木醛制剂的制备1)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛缓释胶囊的工艺如下将硬脂醇在水浴上加热熔融，加入去甲泽拉木醛搅匀，冷后，研碎，加羟丙甲纤维素凝胶制成软材，制粒，干燥，整粒，装入胶囊即得。2)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛软胶囊的工艺如下去甲泽拉木醛与少量植物油混合，待分散均匀后加入余量植物油混溶，得药液。另配明胶液，其中明胶100份，甘油55份，水100份备用，采用滴制法，制得去甲泽拉木醛软胶囊。3)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛的注射剂工艺如下去甲泽拉木醛加适量乙醇和丙二醇研匀，分次加入水混合，微孔滤膜过滤，分装玻璃安瓿中，灭菌，即得。4)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛的软膏剂工艺如下取单甘酯，十八醇和液状石蜡加热使熔融。另取去甲泽拉木醛10倍量的氯仿和等量的甲醇，加入到去甲泽拉木醛中，使溶解，再缓缓加入上述已熔融的药液中，温度在80℃，不断搅拌，使均匀。另将尼泊金乙酯、十二烷基流酸钠、甘油和水混合后在直火加热至90℃时全部溶解，待温度至80℃时与上述药液在不停搅伴的情况下，缓缓加入完，再继续不停搅伴直至冷成稠膏状，加入适量阿唑蒽，搅匀即得。本专利技术对原料药去甲泽拉木醛进行了药效及毒理实验，结果如下(一)药效结果1、去甲泽拉木醛在体外对免疫抑制的实验研究1)、去甲泽拉木醛对脾细胞在丝裂原刺激下转化的抑制作用取BALB/c小鼠脾脏制成脾细胞悬液，在含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液中孵育，加入不同浓度的去甲泽拉木醛、环胞素A(CsA)和雷公藤多甙(TII)，分别在ConA和PHA有丝分裂原刺激下，应用MTT方法测定脾细胞的转化情况，了解去甲泽拉木醛对脾细胞转化的抑制程度。结果对脾细胞转化的抑制作用在加入浓度为0.125、0.25μg/ml去甲泽拉木醛时，无论是ConA还是PHA刺激，其0D值与未加去甲泽拉木醛的相当(P＞0.05)，而在浓度为0.5μg/ml和1.0μg/ml的去甲泽拉木醛中，OD值明显下降，与未加去甲泽拉木醛比较有显著性差异(P＜0.001)，显示去甲泽拉木醛对ConA、PHA诱导的脾细胞转化有明显的抑制作用。其中加0.5μg/ml去甲泽拉木醛的0D值比加入1μg/ml的TII的OD值更小(p＜0.05)，与加入1μg/ml的CsA时OD值无差异(p＞0.05)，说明去甲泽拉木醛的抑制作用比TII强，且达到一定浓度时与CsA的抑制作用相当。2)、去甲泽拉木醛对混合淋巴细胞培养的抑制试验取C57BL/6小鼠脾细胞与灭活的BALB/c小鼠脾细胞混合，在RPMI-1640培养液中孵育，并分别加不同浓度的去甲泽拉木醛、CsA或TII，在终止培养前4h加入1μci3H-TdR，将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，在β液闪烁计数仪上测定dpm值，观察脾细胞转化情况，了解去甲泽拉木醛、TII与CsA对脾细胞转化的抑制程度。结果混合脾细胞转化的抑制作用与丝裂原刺激脾细胞转化的试验研究相似，本试验加入不同浓度的去甲泽拉木醛、TII或CsA均显示对脾细胞转化有抑制作用，不同浓度抑制强度不一。加入1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛对混合脾细胞转化抑制作用特别强。3)、去甲泽拉木醛对诱生IL-2抑制作用的试验. 取BALB/c小鼠脾制成脾细胞悬液，在RPMI-1640培养液中孵育，不加或加ConA刺激观察细胞生成IL-2，并加不同浓度的去甲泽拉木醛、TII或CsA，取上清液为待测样本。用依赖IL-2的CTLL-2细胞和已制备的待测样本在RPMI-1640培养液中培养，用MTT方法测定CTLL-2的转化，以标准的rIL-2结果计算样本的IL-2活性。结果去甲泽拉木醛对淋巴细胞生成IL-2的抑制作用在对淋巴细胞的培养中，不加ConA刺激，成熟的淋巴细胞也生成并释放IL-2，其释放量较低。不加抑制药时，在12小时、24小时和36小时培养时间，IL-2的释放量分别是7.50±0.26、2.43±0.12和2.37±0.007u/ml，其中12小时与另两个时间组比较有明显差异(p＜0.001)，显示淋巴细胞释放的IL-2活性以培养12小时最高，去甲泽拉木醛、TII和CsA对成熟淋巴细胞释放的IL-2无影响，证实去甲泽拉木醛无直接的杀伤细胞作用。在培养的淋巴细胞中，加入有丝分裂原ConA后，IL-2的活性显著增高，在不加抑制剂的样本中，其在培养12小时、24小时和36小时中IL-2量分别为48.75±3.14、45.33±2.24和27.37±1.16U/ml，36小时较1 2小时为低(p＜0.05)。在加入去甲泽拉木醛药后，培养12小时去甲泽拉木醛浓度为1μg/ml时，IL-2的抑制十分显著(12.36±2.39U/ml)，与对照样本(48.75±3.14U/ml)比较有显著差别(p＜0.001)，与1μg/ml浓度的TII样本(43.17±2.65U/ml)比较，去甲泽拉木醛样本内IL-2明显低于TII样本，提示去甲泽拉木醛较TII的抑制作用强(p＜0.001)；与各浓度的CsA抑制作用比较，去甲泽拉木醛的抑制作用不及CsA作用强，CsA在0.25、0.5、1μg/ml时的IL-2活性分别是10.17±1.59、8.70±0.46、5.37±0.70u/ml，均有显著性抑制，其IL-2的生成量较1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛均低。值得提出的是与CsA和对照样本比较，IL-2活性应随12小时、24小时、36小时时间的延长而逐渐消耗减少，但在有去甲泽拉木醛的样本内培养12小时至36小时，IL-2活性并未见减低的趋势，提示去甲泽拉木醛除有抑制IL-2生成外，还有抑制IL-2受体活性的作用，而减少IL-2的消耗。4)、去甲泽拉木醛对重组IL-2促进CTLL-2细胞增殖的抑制作用在依赖IL-2的CTLL-2细胞悬液中加入不同浓度的去甲泽拉木醛、TII、CsA，并加rIL-2使CTLL-2转化，用MTT方法测定OD值，了解去甲泽拉木醛对rIL-2促CTLL-2细胞转化的抑制作用。结果在培养的依赖IL-2的CTLL-2细胞中加入rIL-2，空白OD值为0.154±0.013，当加入0.5μg/ml和1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛后，其OD值明显下降，分别为0.024±0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
种免疫抑制药物，其特征是含有有效剂量的去甲泽拉木醛和药学上可接受的赋形剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春欣，林宗明，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]