一种具有下列结构的新化合物，其制备方法，式中Ｒ↓［１］代表乙酰基、或氢原子，Ｒ↑［２］代表卤素原子、氯、溴、碘，这种化合物组成的试剂，用于检测体液中β－Ｄ－半乳糖苷酶，其方法适宜采用速率法，双速率法及终点法，灵敏、精确、快速。＊＊＊。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种检测β-D-半乳糖苷酶底物的制备方法，还涉及由该化合物组成的试剂，用于检测体液中β-D-半乳糖苷酶的应用方法。目前在临床化学中用于检测β-D-半乳糖苷酶活性的试剂较多，如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(简称PNP-GAL);4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷(简称4MU-GAL)，及西德Boehringer Mannheim公司研制的氯酚红基-β-D-半乳糖苷(简称CPR-GAL)。以上都采用的是终点比色法。当用PNP-GAL检测β-D-半乳糖苷酶时，因有尿液底色的干扰，需做样品空白(SB)试验，且操作复杂;当用4MU-GAL时，则需要昂贵的荧光分析仪;而用CPR-GAL试剂时，虽然其水溶性很好，其缺点本底颜色太深，使结果观察产生困难。这三种试剂均不能采用速率法在自动分析仪上使用。根据目前临床化学应用中存在的问题，本专利技术的目的是，提供一种新底物的制备方法。另一个目的是提供一种快速简便的检测方法。 本专利技术提供的新底物具有(Ⅰ)式通式结构，其主要特征在于式中R1代表氢原子或是乙酰基，R2代表卤素原子、氟、氯、溴、碘。所述方法的特征在于(ⅰ)将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物 在C1-C4酮类有机溶剂中，碱性条件下发生反应。(ⅱ)或在相转移催化剂的参与下(其中优选的是苄基三乙基溴化铵)在C1-C5卤代烃类溶剂中，加热回流进行缩合反应。本专利技术提供的制备方法，及临床化学应用方法，可通过实施例详细说明。实施例12-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷的制备(简称CNP-GAL)方法(1)在250ml三颈瓶上装有回流冷凝器，机械搅拌及温度计，向反应瓶中加入100ml氯仿，10g，2、3、4、6-四-氧-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴(24.3mmol)，8.4g2-氯-4硝基苯酚(48.4mmol)，苄基三乙基溴化铵5.5克及1N NaOH溶液48ml;在回流状态下，反应3小时，，将反应物冷却，加入水100ml，在分液漏斗中分离出氯仿层，将氯仿层用1N NaOH30ml洗涤两次，再将氯仿溶液用无水硫酸镁干燥、过滤，在减压下蒸出滤液中的氯仿，残余物用无水乙醇重结晶，得黄色凝胶状物质，2-氯-4-硝基苯基-四-氧-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷10.8克，mp，160.5-161℃。元素分析理论值 C47.68% H4.4%实测值 C47.32% H4.59%将上述产品7.6克加入75ml无水甲醇中，在搅拌状态下加入1N甲醇钠的甲醇溶液1.5ml，在室温下搅拌半小时，放置4℃过滤，将产品过滤出来，在甲醇加水混合溶剂中重结晶，得出白色针状结晶。2-氯-4-4硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(CNP-GAL)3.8克，mp，204-204.5℃。元素分析理论值C42.94% H4.2%实测值C42.58% H4.29%方法(2)CNP-NAG为2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷。检测试剂(G2)按照方法(1)中配制G1的方法，用CNP-NAG替代CNP-GAL，使CNP-NAG的浓度2mmol。检测试剂(G3)配制方法同G1，但CNP-GAL的浓度为5mmol/L。步骤吸取样品(S)20ul再吸取(G2)试剂300ul，加液后1分钟测吸光值变化率(2)分;在加G2试剂后5分钟加入G3试剂200ul，亦于1分钟测吸光值变化率(3)分，所得结果NAG酶活力＝吸光值变化率(2)/分×(-4935)，u/L。GAL酶活力＝(吸光值变化率(3)/分-K。吸光值变化率(2)/分)×(-8020);u/L。式中K＝(S+G2)/(S+G2+G3)，计算由自动分析仪完成(见附图2)。方法(3)终点法测定尿中GAL酶活力尿样(X)100ul或蒸馏水(试剂空白RB)100ul，浓度为2mmol/L的CNR-GAL(PH4.6)0.5ml，在37℃下反应15分钟，加终止液(0.3mol/L Na2CO3)1.5ml;用不含CNP-GAL的缓冲液替代糖苷溶液做样品空白(SB)于4000nm处测各管的吸光度A，则半乳糖苷酶的活力为GAL＝(Ax-Arb-Asb)×50，u/L在500ml反应瓶中加入10.7克，2、3、4、6-四-氧-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴，9克(52mmol)2-氯-4-硝基苯酚，200ml丙酮，搅拌下加入1N NaOH70ml，当全部固体溶解以后，在室温放置5小时，4℃过夜，减压下蒸出丙酮，加水过滤，固体用无水乙醇重结晶，得到凝胶状固体，干燥后得黄色粉末5.4克。将上述产品按照方法(1)的步骤，得终产品CNP-GAL1.8克。实施例2方法(1)应用2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷试剂，单速率法测定尿中GAL酶活力。仪器日立705自动分析，波长415nm，温度37℃。检测试剂(G1)在浓度为50mmol/l的柠檬酸缓冲溶液中(PH＝5.0)，溶入CNP-GAL和β-环糊精，使CNP-GAL的浓度为2mmol/l，β-环糊精浓度为4克/L。步骤吸取样品(S)20uL，加试剂(G1)300uL，，混合后1分钟测吸光值变化率(1)。半乳糖苷酶活力＝吸光值变化率(1)/分×(-4935)，u/L(见附附图说明图1)。方法(2)双速率法应用CNP-NAG和CNP-GAL试剂，同杯测定乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和GAL酶的活性。仪器同方法(1)权利要求1.制备如下式(Ⅰ)所示的β-D-吡喃半乳糖苷的方法，其中R1代表氢原子或是乙酰基，R2代表卤素原子氟、氯、溴、碘，所述的方法其特征在于(i)将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物在C1-C4酮类有机溶剂中，碱性条件下发生反应。(ii)或在相转移催化剂的参与下(其中优选的是苄基三乙基溴化铵在C1-C5卤代烃类溶剂中，加热回流进行缩合反应。2.根据权利要求1的方法，其特征还在于式Ⅰ化合物，其中R1是代表氢或的乙酰基。3.根据权利要求1的方法，其特征在于式(Ⅰ)化合物，其中R2是代表卤素原子、氟、氯、溴、碘。4.根据权利要求1的方法，其特征还在于在相转移催化剂参与下反应。全文摘要一种具有下列结构的新化合物，其制备方法，式中R文档编号C07H15/203GK1057266SQ9010415公开日1991年12月25日 申请日期1990年6月9日 优先权日1990年6月9日专利技术者胡宗华, 魏有仁, 胡宗元, 丁晓琴 申请人:天津市医药科学研究所, 中日友好医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备如下式（Ⅰ）所示的β－Ｄ－吡喃半乳糖苷的方法，＊＊＊（Ⅰ）其中Ｒ１代表氢原子或是乙酰基，Ｒ２代表卤素原子氟、氯、溴、碘，所述的方法其特征在于：（ｉ）将式（Ⅱ）化合物与式（Ⅲ）化合物＊＊＊（Ⅱ）＊＊＊（Ⅲ）在Ｃ↓［１］ －Ｃ↓［４］酮类有机溶剂中，碱性条件下发生反应。（ｉｉ）或在相转移催化剂的参与下（其中优选的是苄基三乙基溴化铵在Ｃ１－Ｃ５卤代烃类溶剂中，加热回流进行缩合反应。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡宗华，魏有仁，胡宗元，丁晓琴，
申请(专利权)人：天津市医药科学研究所，中日友好医院，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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