具有酰胺骨架的寡聚核苷酸制造技术

＊＊＊ 下式具有酰胺连接基团的寡聚体及其盐： 其中Ｒ↑［１］为Ｈ、Ｃ↓［１－４］烷基、Ｃ↓［１－１８］酰基或羟基－低级烷基；Ｒ↑［２］为Ｈ、芳烷基、或Ｃ↓［１－４］烷基；Ｂ为选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的核苷碱基；Ｘ为Ｈ、ＯＲ↑［１］、ＮＨＲ↑［２］或ＮＨ－酰基；Ｙ为ＯＲ↑［２］或ＮＨＲ↑［２］；以及ｎ为５至２５的数字。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成的寡聚核苷酸与RNA或单链DNA之间的高度特异性反应已在分子生物学中有许多应用。寡聚核苷酸在克隆、诊断分析中用作杂交探针，且在聚合酶链反应(PCR)技术中用作必需的引物。通过Watson Crick碱基配对原则控制结合的特异性。根据这一特征，只需知道目的RNA或DNA的序列便可几乎直接地设计寡聚核苷酸。作为这一有吸引力的原理的进一步扩展，已经研究将寡聚核苷酸与其互补mRNA序列相结合作为抑制特定蛋白产物的转录过程的新工具。Zamecnik和Stephenson在1978年阐明了这一方法抑制被感染的鸡成纤维细胞中劳斯肉瘤病毒的生长中的实用性(Zamecmik，P.C.；Stephenson，M.L.Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.1978.75，280)。这一开拓性工作促使了该领域研究的发展，并对扩展这一理论用于治疗产生了更多兴趣。由于所用的寡聚核苷酸剂与mRNA靶中包含的遗传信息的意义互补(相反)，所以这种新方法被称为“反义DNA”技术。硫代磷酸酯是广为人知的反义化合物。它们是用硫代替磷酸双酯基团中的一个氧的骨架类似物。这一保守修饰为分子提供了核酸酶抗性并使其在细胞培养物及动物模型中显示出生物学活性。硫代磷酸酯反义药物已作为抗病毒或抗癌药进入临床实验评价阶段。尽管硫代磷酸酯反义药物的潜力是有前途的，但由于副作用的原因，需要新型的反义药物。特别是由于硫代磷酸酯的聚硫酯骨架是离子型的，所以它们表现出非反义副反应。这些副反应影响到蛋白质的结合(Stein，C.A.；Narayanan，R.Current Opinion inOncology，6(1994)587)、免疫细胞及转录因子的激活(Branda，R.F.；Moore，A.L.；Mathews，L.；McCormack，J.J.；Zon，G.Biochem.Pharmacol.1993，8，33；以及McIntyre，K.W.等Antisense Res.Devel，1993，3，309)，并且由于部分互补结合，引起非目的序列的RNA酶H的裂解(Giles，R.V.；Spiller，D.G.；Tidd，D.M.Anticancer Drug Design 1993，8，33)。为了降低离子型骨架引起的非反义活性，已经合成了一些掺入几个用酰胺代替磷酸二酯连接基团进行修饰之残基的寡聚核苷酸(Burgess，K.；Gibbs，R.A.；Metzker，M.L.；Raghavachari，R；J.C.S.Chem.Commun.1994，915；Chur，A.；Holst，B.；Dahl，O.；Valentin-Hanesn，P.；Pedersen，E.B.；Nu-cleic Acid Res.1993，21，5179；Idziak，I.；Just，G.；Damha，M.；Giannaris，P；Tet.Lett.1993，34，5417；De Mesmaeker，A.；Waldner，A.；Lebreton，J.；Hoffmann，P.；Fritsch，V.；wolf，R.；Freier，S.；Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.1994.33，226)。将这些修饰后的连接基团掺入单链DNA分子通常会引起其与互补RNA或DNA的结合亲和力下降。但还未报道过用酰胺基团全部取代磷酸二酯基团的实例。另一类具有较高结合亲和力的类似物是肽核酸(PNA)(Nielsen，P.；Egholm，M.；Berg，R.；Buchardt，O.；Science.1991，254，1497)。这些分子含有与肽骨架而不是糖—磷酸骨架相连的常见核酸碱基—腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。尽管这类化合物具有与DNA和RNA的高度结合亲和力，但这类化合物与反向平行互补及平行互补的RNA序列的结合特异性差。另外，这种分子的水溶性差，使之成为实际应用中的缺陷。因此，需要一种其骨架连接基团具有多种特征的反义分子，即连接基团应对酶的裂解稳定，应为中性从而可避免与多阴离子结构相关的副作用，当与RNA结合时应具有可接受的亲和性及特异性，并且应具有所需的物化性质，如水溶性。本专利技术的反义分子满足了这些要求。与现有技术不同，本专利技术的反义分子是一种新型的寡聚核苷酸，其中整个磷酸二酯连接而成的骨架被酰胺连接而成的骨架所代替。本专利技术提供了一类新型的寡聚体(寡聚核苷酸)，它是由被酰胺连接基团连接起来的修饰核苷单体单位组成的。可用例如固相或溶液偶联法通过单体中间体(也是本专利技术的一部分)寡聚反应来合成这些化合物。由于本专利技术的特异结构，此处公开的反义分子具有稳定性及水溶性方面的优点，并可避免离子的副作用及非特异性蛋白结合。具体地说，本专利技术目的在于具有下列结构的寡聚体 式I中，R1可为H，含有一至四个碳原子(C1-C4)的低级烷基，含有一至十八个碳原子(C1-C18)的酰基，或羟基—低级烷基；R2为H，芳烷基或含有一至四个碳原子(C1-C4)的低级烷基；B为选自包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的核苷碱基；X可为H、OR1、NHR2或NH-酰基；Y可为OR1或NHR2；以及n可为5至25的任一数字。该寡聚体能够与所选的mRNA序列结合。优选地，所述寡聚核苷酸化合物具有与所选的RNA序列互补的碱基序列。还包括本专利技术化合物的盐。R1可具体地为甲基、乙酰基或羟乙基。在一具体实施方案中R2为H，X为H、OR1或NHR2以及R1，B和Y同上式I中所定义的。在一优选化合物中R1和R2均为H或R1为甲基、R2为H2在一优选的组合中X为NH2或NH-酰基，Y为OH或NH2，R1为H或酰基，R2为H以及n为6—13。另外，具有上述结构但在B位上具有适当保护的核苷碱基(下面定义为B′)并且其中m(而不是n)为0至5的寡聚体也是本专利技术的一个目的，特别是其中m为0、1或2。这样的寡聚体可用作其中n为5至25的寡聚体的中间体。式I的寡聚体是由被酰胺连接基团连接起来的经修饰的核苷单体组成的。本专利技术的寡聚体适用于与寡聚体相关的任何用途，特别因为它比未修饰连接基团的寡聚体提高了稳定性，比其它类型已修饰连接基团的寡聚体提高了特异性和水溶性。另外，按照本专利技术的方法可以获得其所有核苷组分被酰胺连接基团连接的寡聚体。由于这些寡聚体具有酰胺连接基团，因此可装配成稳定、溶于水、特别是有核酸酶抗性的反义化合物。因此，本专利技术的寡聚体可用作反义治疗药，与目的mRNA结合阻断或减低目的蛋白的生成。按照Akhtar和Ivinson在Nature Genetics，1993 4，215中阐述的方法进行反义治疗。作为设计反义寡聚体的实例，可选择引起不良情况或与不良情况相关的目的蛋白，然后用已知方法获得该蛋白相应的基因或mRNA的核苷酸序列，从而可设计出与该序列的一部分互补的寡聚体。可根据mRNA编码蛋白这一基础来确定mRNA序列，该蛋白的翻译需被阻断，从而降低或消除该蛋白的生成，来减低由于该蛋白的存在所引起的不良作用。可通过用遗传密码翻译被编码蛋白质的序列来测定未知的mRNA序列。如果不知道蛋白质的序列，则可用已知技术分离蛋白质并测定其序列。另外，可用已知方法鉴别、分离编码该蛋白的mRNA或DNA并测定其序列。该寡聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下列结构的寡聚体及其盐：＊＊＊ Ⅰ其中Ｒ↑［１］为Ｈ、Ｃ↓［１－４］烷基、Ｃ↓［１－１８］酰基或羟基－低级烷基；Ｒ↑［２］为Ｈ、芳烷基、或Ｃ↓［１－４］烷基；Ｂ为选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的核苷碱基；Ｘ为Ｈ、Ｏ Ｒ↑［１］、ＮＨＲ↑［２］或ＮＨ－酰基；Ｙ为ＯＲ↑［２］或ＮＨＲ↑［２］；以及ｎ为５至２５的数字。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文仁，SYK塔姆，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]