针对囊依赖的淋巴细胞白血病基因的反义核酸的抑癌作用制造技术

本发明专利技术涉及用化学方法合成系列序列特异的反义核酸，其碱基排列顺序与人体内Ｂ细胞白血病－２基因（Ｂｃｌ－２）的一段序列互补。这些寡核苷酸可以在细胞内特异地与人体Ｂｃｌ－２基因的信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）杂交，从而阻止Ｂｃｌ－２基因编码的Ｂｃｌ－２蛋白的表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用，这些反义寡聚核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长的药物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抑制人体肿瘤细胞生长的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤生长的针对囊依赖的淋巴细胞白血病—2(B细胞白血病—2，Bcl—2)的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述的寡核苷酸的组合物，以及将所述的寡聚核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术所阐述的寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体Bcl—2基因的一段序列互补，这些寡核苷酸在细胞内特异地与人体Bcl—2基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交，从而阻止Bcl—2基因编码的Bcl—2蛋白表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用(Shinichi kitada，Antisense Research and Development．471—79，1994)。Bcl—2基因主要存在于细胞的线粒体内膜、核膜、内质网膜等细胞器中，分布很广，存于淋巴细胞、未成熟的造血干细胞，上皮细胞、神经细胞等。Bcl—2基因于1984年Tsujimoto从淋巴瘤病人B淋巴细胞中发现。Bcl—2基因对细胞凋亡有明显的抑制作用，并与肿瘤的耐药性密切相关。现已发现许多与Bcl—2基因同源的基因，有Bcl—2、Bcl—XL、BAX、BAK、AI、MCL1、LMWS—HL、BHRF1、CED—9等。该基因家族的共同点是有两个保守序列BH1、BH2(Bcl—2homologuel 1 and 2)，用点突变技术替代BH1 145位甘氨酸和BH2 155位的色氨酸，改变后的Bcl—2失去抗辐射及抗糖皮质激素引起凋亡的能力。Bcl—2基因有3个外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中Ⅰ不翻译，Bcl—2的开放读框位于Ⅱ和Ⅲ的结合区，在Ⅰ和Ⅱ之间有220bp的内含子，在Ⅱ和Ⅲ之间有370bp的内含子。外显子Ⅱ及外显子Ⅰ内剪接位点的5’端都有启动子，用不同的启动子可产生由Ⅰ、Ⅱ或Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组成的不同mRNA。Bcl—2基因可加速细胞分裂、细胞增殖、维护细胞生存、延长细胞寿命，导致细胞数目增加。实验表明Bcl—2转染的细胞存活时间大大增长，Bcl—2抗细胞凋亡机理表明其可调节细胞的氧化还原状态，与BAX结合成杂二聚体，抑制BAX的促调亡作用，影响细胞钙离子的重新分布。钙离子激活内源性的内切酶和谷氨酰胺转移酶，抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆。细胞色素C是促进调亡的，在细胞调亡中，线粒体膜有去极化作用，通透性改变，细胞色素C从而流出线粒体膜外，进入胞浆，从而促进细胞死亡。Bcl—2分子异常表达有促进肿瘤形成的作用，常见于T、B淋巴瘤的发生过程。90％的B细胞滤泡淋巴瘤病人中有t(14；18)的易位，这样14q32上的Ig重链Jh段基因与18q21上有转录活性的Bcl—2基因并置，使Bcl—2基因在Ig重链Jh段的调控下高表达，而且Bcl—2在转基因动物中过量表达，可干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化作用，从而抑制氧化物应激诱导的细胞死亡。Bcl—2在许多类型的人类肿瘤中被表达而且促进其转录，26K道尔顿Bcl—2蛋白被封闭可以导致细胞程序化死亡(Michael．L．cleary，Cell(47)10．1986．19—28)。Bcl—2通常在非何杰金淋巴瘤上表达可以引导抵抗程序化细胞死亡和促进肿瘤生长(Webb．D．Cunningham．TheLancet．349．April．19．1997，1137—1141)。如果用反义寡聚核苷酸攻击Bcl—2的mRNA，可以使Bcl—2表达下降，从而使程序化细胞死亡增加，这样可以有效的抑制肿瘤的生长(Fionna．J．Keith，Leukemia 1995．9．131—138)。Bcl—2基因与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏损伤、心血管系统疾病、肿瘤等有关，如肾小球肾炎中系膜增殖型肾小球肾炎，发现能表达细胞凋亡的抑制基因Bcl—2的细胞数与细胞增殖有明显的相关性。试验证明，Bcl—2过量表达可以使肾小球肾炎中系膜细胞数目增多，增殖时间延长。上述有关Bcl—2基因在肿瘤发生中起作用的研究使得人们将Bcl—2基因作为肿瘤治疗用药的靶点。大量的筛选工作表明，可以筛选出许多分子，其中大多数作用于细胞器的活性部位或调节位点。希望筛选出的分子可以作为抗癌药物，能够发挥与现存的抗癌药不同的药物机理，而且这些分子可以产生细胞生长抑制但不产生细胞毒性。然而很大的不利点在于这些化合物虽然有时对Bcl—2基因是特异性的，但对其他基因却显示不出很强的选择能力。Bcl—2基因在肿瘤发生和生长调控方面的深入研究还在进一步进行，是否能够通过针对Bcl—2基因的调控来抑制肿瘤的生长还要不断研究，否则会造成与肿瘤发生无关的针对Bcl—2基因调控的很多不希望出现的副作用。我们所选择的反义核酸是通过与Bcl—2的mRNA互补杂交，通过多种机制来抑制mRNA表达Bcl—2蛋白。由于反义核酸可特异性的结合目标mRNA，可以设计出一种反义核酸，要求其与肿瘤发生有关的Bcl—2的mRNA互补，高度的特异性选择亦可使之不产生目前其他药物所产生的毒副作用。本专利技术在细胞培养中筛选出对Bcl—2特异的反义核酸，结合于Bcl—2基因的mRNA 3’端非翻译区，显示出对Bcl—2的mRNA表达蛋白质的抑制。目前研究表明Bcl—2基因表达下降，可以促进程序化细胞死亡，进而抑制肿瘤生长，达到治疗目的。本专利技术的目的之一是能够提供一种反义寡聚脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其特征在于可特异性结合Bcl—2基因的mRNA的不同区域。本专利技术的另一目的是提供含有本专利技术反义寡聚核苷酸的药物组合物。本专利技术的另一目的是提供了本专利技术反义寡聚核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术还设计了一系列可以结合于Bcl—2基因的Bcl—2的mRNA的不同区域的反义核酸分子，在细胞培养中筛选对Bcl—2基因表达特异性抑制的反义核酸。细胞培养采用A549细胞，设立一个阴性对照PAC23b，两个阳性对照PAC14、PAC66，所有进行筛选的反义核酸分子长度均为20个核苷酸。筛选结果表明其中九个反义核酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为PAC60、PAC61、PAC62、PAC63、PAC64、PAC67、PAC68、PAC69、PAC70，其中PAC63能最大地抑制人体肿瘤细胞生长的活性。具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的PAC系列反义寡聚核苷酸碱基组成及顺序如下所示PAC60 5’—AGT CCG GTA TTC GCA GAA GT—3’ 20merPAC61 5’—CAA TGT ATT AAG CTG CCT GG—3’ 20merPAC62 5’—GTC TAC TTC CTC TGT GAT GC—3’ 20merPAC63 5’—CGC GGA ACA CTT GAT TCT GG—3’ 20merPAC64 5’—AGG AGT TAT AAT CCA GCT AT—3’ 20merPAC67 5’—CAG TAA ATA GCT GAT TCG AC—3’ 20merPAC68 5’—TCC GTC TGC TCT TCA GAT GG—3’ 20merPAC69 5’—CGA TCT CGG ACC TGT GGC CT—3’ 20merPAC70 5’—TTC GCC GGC TCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡聚反义脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）或核糖核酸（ＲＮＡ），其特征在于可特异性结合人体Ｂ细胞白血病－２（Ｂｃｌ－２）基因的不同区域，所述寡聚核苷酸序列选自：１．ＰＡＣ６０：５’－ＡＧＴ ＣＣＧ ＧＴＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＴ－３’ ．ＰＡＣ６１：５’－ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＧ－３’３．ＰＡＣ６２：５’－ＧＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＡＴ ＧＣ－３’４．ＰＡＣ６３：５’－ＣＧＣ ＧＧＡ ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＧＧ －３’５．ＰＡＣ６４：５’－ＡＧＧ ＡＧＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＡＴ－３’６．ＰＡＣ６７：５’－ＣＡＧ ＴＡＡ ＡＴＡ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＣＧ ＡＣ－３’７．ＰＡＣ６８：５’－ＴＣＣ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＧ－３’８．ＰＡＣ６９：５’－ＣＧＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＣＴ－３’９．ＰＡＣ７０：５’－ＴＴＣ ＧＣＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＣＣ ＴＣ－３’及其同源序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡前进，
申请(专利权)人：北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]