脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液及以Pickering乳液为模板聚合含酶微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液及以此Pickering乳液为模板聚合含酶微球的制备方法，将凹土分散于磷酸盐缓冲液中形成分散液，分散液再与脂肪酶酶液混合，得水相；以引发剂2,2‑偶氮二异丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸甲酯(MMA)及乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)溶解于甲苯中，得油相；油相和水相混合后，高速打浆，即形成酶与凹土协同稳定的水包油型(O/W) Pickering乳液；Pickering乳液通氮除氧后，移至恒温装置聚合；反应结束后，冷却至室温，用磷酸盐缓冲液洗涤产物多次，得含酶微球。本发明专利技术将酶的固化过程与乳液聚合过程同步进行，生物催化剂脂肪酶不仅起固有的催化作用，而且在乳液形成中起乳化剂作用，赋予了所得微球催化性能，给酶的固定化提供了一条新的途径。

Lipase stabilized Pickering emulsion stabilized by Attapulgite and method for preparing enzyme containing microsphere by using Pickering emulsion as template

The present invention discloses Pickering emulsion stability and synergistic lipase Attapulgite on Pickering emulsion polymerization preparation method of enzyme containing microspheres as the template, will form the dispersion of attapulgite dispersed in phosphate buffer, dispersion and lipase solution was mixed to aqueous phase; initiator 2,2 two azo isobutyronitrile (AIBN) methyl methacrylate (MMA) and two ethylene glycol methacrylate (EGDMA) dissolved in toluene, oil phase; oil and water after mixing, high speed, that the formation of oil in water type enzyme and attapulgite (O/W) Co stable Pickering emulsion; Pickering emulsion deoxygenating, moved to the thermostatic device polymerization; after the reaction, cooling to room temperature, washed with phosphate buffer containing the enzyme product repeatedly, microspheres. The process of curing process and emulsion polymerization of the enzyme simultaneously, lipase catalysis biological catalyst not only inherent, but also in the formation of the emulsion emulsifier, given the catalytic performance of the microspheres, provides a new way for enzyme immobilization.

【技术实现步骤摘要】
脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液及以Pickering乳液为模板聚合含酶微球的制备方法
本专利技术涉及一种利用天然矿物材料及生物催化剂协同乳化并聚合成微球的制备方法，属于天然矿物资源利用

技术介绍
Pickering乳液是一种由固体颗粒代替了传统的有机表面活性剂稳定乳液体系的新型乳液，较一般乳液更稳定。黏土类的乳化剂在形成乳液时往往呈现三维网络结构，稳定性更高；由于黏土是天然的矿物，环保，大规模应用性价比更高；相较于球形固定颗粒，呈层状及纤维状的黏土仅很少的量就能覆盖于球体表面，可以减少乳化剂的用量，节约成本。酶是具有催化活性的蛋白质，但酶直接催化时，受环境影响较大，酶的固定化技术因此发展起来。固定化酶的应用，可提高酶的稳定性及循环使用次数。
技术实现思路
本专利技术目的在于：提供一种脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液及以此Pickering乳液为模板聚合含酶微球的制备方法，采用酶这种具有催化活性的蛋白质与凹土协同制备Pickering乳液，并以此Pickering乳液为模板聚合成微球，将酶直接固定于微球表面，使得体系中的酶不仅起乳化剂作用，同时还赋予微球催化性能，给酶的固定化提供新的途径。本专利技术的技术解决方案是该Pickering乳液的制备方法包括以下步骤：（1）将凹土分散于磷酸盐缓冲液中形成分散液，分散液再与一定浓度的脂肪酶酶液混合，得水相；所述脂肪酶酶液是指脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中形成的溶液，简称酶液。（2）以引发剂2,2-偶氮二异丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸甲酯(MMA)及乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)溶解于甲苯中，得油相；（3）将步骤（2）的油相和步骤（1）的水相混合后，高速打浆，即形成酶与凹土协同稳定的水包油型(O/W)Pickering乳液。其中，凹土分散液的浓度为1.5-2.5w/v%，酶液浓度为0.065-0.135wt%，凹土分散液与酶液体积比为4:1。其中，在2.0-4.0mL甲苯中，加入0.015-0.025g引发剂2,2-偶氮二异丁腈（AIBN）、0.65-2.35mL甲基丙烯酸甲酯(MMA)以及0.35-0.65mL乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，充分混合，得油相。其中，以Pickering乳液为模板聚合含酶微球的制备方法是：Pickering乳液通氮除氧后，移至恒温装置聚合；反应结束后，冷却至室温，用磷酸盐缓冲液洗涤产物多次，得含酶微球。其中，50℃的油浴锅中聚合反应1.0-3.0h。本专利技术的优点在于:1、酶的固定化过程与乳液聚合同步进行，这给酶的固定化方法提供了一条新的途径；2、酶一般只做生物催化剂，但是本专利技术中的酶不仅起催化剂的作用，同时还在乳液稳定中起乳化剂的作用，使所得乳液更加稳定；3、赋予所得微球催化功能，拓宽了Pickering乳液的应用范围。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本专利技术的技术解决方案，这些实施例不应理解为是对技术方案的限制。实施例1：称取0.15g凹土于8mLpH值为7.4的磷酸盐缓冲液中超声分散5min，加入0.065wt%的脂肪酶酶液2mL，混合均匀(其中凹土为1.5w/v%)，得水相；在一只50mL的圆底烧瓶中依次加入4.0mL甲苯、0.015gAIBN、0.65mLMMA以及0.35mLEGDMA，使其充分混合，得油相；将水相和油相倒入圆底烧瓶中，用FS-1可调高速均浆机以10000转/分钟的速度打浆3min，得到Pickering乳液。Pickering乳液通氮除氧30min，将圆底烧瓶转移至50℃的油浴锅中进行聚合反应3.0h；反应结束后，待其冷却至室温，用磷酸盐缓冲液洗涤产物多次，得含酶微球即样品S1。实施例2：称取0.20g凹土于8mLpH值为7.4的磷酸盐缓冲液超声分散5min，加入0.100wt%的酶液2mL，混合均匀(其中凹土为2.0w/v%)，得水相；在一只50mL的圆底烧瓶中依次加入3.0mL甲苯、0.020gAIBN、1.5mLMMA以及0.5mLEGDMA，使其充分混合，得油相；将水相和油相倒入该圆底烧瓶中，用FS-1可调高速均浆机以10000转/分钟的速度打浆3min，得到Pickering乳液。Pickering乳液通氮除氧30min，将圆底烧瓶转移至50℃的油浴锅中进行聚合反应2h；反应结束后，待其冷却至室温，用磷酸盐缓冲液洗涤产物多次，得含酶微球即样品S2。实施例3：称取0.25g凹土于8mLpH值为7.4的磷酸盐缓冲液超声分散5min，加入0.135wt%的酶液2mL，混合均匀(其中凹土为2.5w/v%)，得水相；在一只50mL的圆底烧瓶中依次加入2.0mL甲苯、0.025gAIBN、2.35mLMMA以及0.65mLEGDMA，使其充分混合，得油相；将水相和油相倒入该圆底烧瓶中，用FS-1可调高速均浆机以10000转/分钟的速度打浆3min，得到Pickering乳液。Pickering乳液通氮除氧30min，将圆底烧瓶转移至50℃的油浴锅中进行聚合反应1h；反应结束后，待其冷却至室温，用磷酸盐缓冲液洗涤产物多次，得含酶微球即样品S3。上述样品的酶活测定均选用铜皂法：取1.7mL磷酸盐缓冲溶液和0.6mL橄榄油，放入水浴恒温磁力搅拌器37°C中预热5min，加入0.03g含酶微球，磁力搅拌10min，立即加入4.5mL甲苯，搅拌2min，终止反应，同时萃取生成的脂肪酸；将上述溶液移至离心管中，4000r/min离心10min，有机相和水相分层澄清；取上层有机相4mL，加入1mL显色剂，磁力搅拌3min后移至离心管中，4000r/min离心10min，取上清液，用分光光度计在710nm波长测其吸光值；以相同方法制备不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度工作曲线，即求得脂肪酸的浓度。通过铜皂法测脂肪酶的酶活来考察实施例1-3所得的含酶微球的酶活、热稳定性、储存稳定性及循环使用情况。热稳定性是将含酶微球置于50°C环境中，每隔一个小时测其酶活，比较酶活降至初始酶活的70%以下所用时间。储存稳定性是将含酶微球置于4°C环境中，每隔一天测其酶活，比较酶活降至初始酶活的70%以下所用时间。循环使用主要是比较使用1次后的相对酶活。实验结果如下表所示：。本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液，其特征是该Pickering乳液的制备方法包括以下步骤：（1）将凹土分散于磷酸盐缓冲液中形成分散液，分散液再与脂肪酶酶液混合，得水相；所述脂肪酶酶液是指脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中形成的溶液，简称酶液；（2）以引发剂2,2‑偶氮二异丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸甲酯(MMA)及乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)溶解于甲苯中，得油相；（3）步骤（2）的油相和步骤（1）的水相混合后，高速打浆，即形成酶与凹土协同稳定的水包油型(O/W) Pickering乳液。

【技术特征摘要】
1.脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液，其特征是该Pickering乳液的制备方法包括以下步骤：（1）将凹土分散于磷酸盐缓冲液中形成分散液，分散液再与脂肪酶酶液混合，得水相；所述脂肪酶酶液是指脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中形成的溶液，简称酶液；（2）以引发剂2,2-偶氮二异丁腈（AIBN）、甲基丙烯酸甲酯(MMA)及乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)溶解于甲苯中，得油相；（3）步骤（2）的油相和步骤（1）的水相混合后，高速打浆，即形成酶与凹土协同稳定的水包油型(O/W)Pickering乳液。2.根据权利要求1所述的脂肪酶协同凹土稳定的Pickering乳液，其特征是：凹土分散液的浓度为1.5-2.5w/v%，酶液浓度为0.065-0.135...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈敏，陈静，丁师杰，金叶玲，吴洁，王志辉，倪伶俐，张鹏颖，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32