具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统技术方案

本发明专利技术提供一种具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统，将L型多肽YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF逆序并以D构型的氨基酸替代后得到

Ovarian tumor targeting D configuration polypeptide and gene delivery system thereof

The invention provides a ovarian tumor targeting D configuration polypeptide and a gene delivery system thereof, wherein the L type polypeptide YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF is inverted in sequence and replaced by an amino acid of the D configuration

【技术实现步骤摘要】
具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统
本专利技术涉及D构型多肽及基因递释系统，特别是具有与卵巢癌细胞高活性结合，具有卵巢癌靶向的D型多肽及其修饰的基因递释系统。
技术介绍
卵巢癌的死亡率高居妇女癌症死亡率的前五位，并居妇科恶性肿瘤的首位。大多数卵巢癌患者在诊断时已处于晚期，而晚期卵巢癌的治疗一直是一个很棘手的问题。尽管手术的改进、新药物的上市、新化疗方案的推出在一定程度上提高治疗效果，但5年生存率仍未见明显提高。化疗是晚期卵巢癌治疗的重要手段，但是多数晚期患者在治疗后复发或耐药，导致治疗失败。其主要原因是药物生物分布不均，药物无法在肿瘤组织得到有效浓度聚集，对正常的组织及器官有极大的毒副作用。因此，有必要探寻新的卵巢癌治疗手段。靶向治疗使肿瘤治疗进入一个新的时代。常见的靶向治疗递药系统有纳米材料载体、脂质体材料载体及病毒载体。其各有优缺点。但其中以线性聚乙烯亚胺（PEI）为载体材料包裹药物、基因形成的纳米复合物对肿瘤进行靶向治疗最为常见。其有很高的药物承载性、稳定性及转染效率。聚乙二醇(PEG)对PEI的修饰降低了其毒性作用，同时可以连接相应的靶向配体（如：多肽、抗体等），通过受体介导内吞作用，增加靶细胞对载药系统的特异性摄取，选择性的递送更多药物进入肿瘤病灶，最终使得相同剂量药物的疗效最大化，而毒副作用最小化。在另一方面，选择一个有高特异性及结合能力的靶向配体亦是靶向治疗的关键。卵巢是卵泡刺激激素（FSH）的靶器官,FSH通过卵泡刺激激素受体（FSHR）刺激卵巢中卵泡的生长。FSHR可以在卵巢表面上皮及大部分卵巢癌组织及细胞系中找到，并且FSHR在人体中的分布比较局限，大多集中在生殖系统。目前，FSHR结合位点已经被确认，集中在FSHR重链的1-15,33-53,51-65,81-95氨基酸处。我们前期研究设计了与其位点对应结合的多肽片段，经过实验验证后表明在33-55氨基酸处的多肽与FSHR的结合力最强。其序列结构为L-FP21(YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF)。故选择此多肽作为纳米递药系统的靶向配体。实验表明FSHR结合片段对纳米材料的修饰能够有效提高其对所包载的化疗药物或基因药物的特异性递送能力，FSHR是一种较为适宜的卵巢癌治疗靶位点。目前，越来越多的多肽配体应用在药物靶向治疗领域。但自然的多肽在人血液中并不稳定，非常容易被血清中的蛋白酶降解，这影响了多肽配体的靶向效果。目前，尚未见到关于含有序列多肽修饰的非病毒基因递释系统及其在体内外转染效率评价以及抗卵巢癌作用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统，将L型多肽YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF逆序并以D构型的氨基酸替代后得到D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)序列多肽，作为靶向分子，利用其与FSHR的高亲和性，将基因靶向输送至卵巢癌细胞处；并且，将D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)修饰到PEI-PEG表面制得D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI（D-FP21-PP）基因载体，所述基因载体包载治疗基因Gro-ɑshRNA；可以显著提高裸鼠皮下瘤的抑瘤率。所述D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)多肽的N端氨基与含有琥珀酰亚胺-聚乙二醇的阳离子多聚物连接，制得非病毒基因载体材料D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-X复合物；该复合物可包载报告基因或治疗基因形成非病毒基因递释系统；其中，该复合物中X是聚乙烯亚胺（PEI）、树枝状聚合物（PAMAM）、多聚阳离子氨基酸、壳聚糖或阳离子脂质体；所述的D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-X复合物可以包载报告基因或治疗基因；所述的D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，还修饰脂质体、纳米粒、聚合物胶束和高分子载体等纳米给药系统以实现肿瘤靶向。所述D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)序列多肽，采用固相合成法制备，将D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)多肽通过双功能分子NHS-PEG-Mal连接到PEI上，制得D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI;D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY-PEG-PEI包载pDNA。所述基因递释系统分别为：D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI、D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-壳聚糖和D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-阳离子脂质体等基因递释系统。所述的基因递释系统具有卵巢肿瘤靶向特征，可以提高卵巢肿瘤体外基因转染效率，可携带治疗基因蓄积于卵巢肿瘤组织，用于卵巢肿瘤的治疗。所述的多肽D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，还与抗癌化疗药物联合使用，与化疗协同治疗卵巢癌。D型多肽同时保留了L型多肽的生物活性,同时可以抵抗蛋白酶的降解，在血中有较好的稳定性。D构型多肽及基因递释系统，具体涉及与卵巢癌细胞表面蛋白FSHR的高结合活性、具有卵巢肿瘤靶向的D构型多肽及其修饰的基因递释系统。D构型多肽，其氨基酸序列为D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)，该多肽与卵泡刺激激素受体（FSHR）有高结合活性、具有卵巢肿瘤靶向；本专利技术提供了由所述D构型多肽修饰的基因递释系统，所述D构型多肽可以介导纳米递释系统向肿瘤靶向递送药物，用于实现向卵巢肿瘤的靶向治疗。本专利技术的优点在于，本专利技术构建的D构型多肽，与卵泡刺激激素受体FSHR具有高结合性、具有靶向卵巢肿瘤的能力；提供D构型多肽修饰的基因递释系统，可以介导纳米递释系统向肿瘤靶向递送药物，用于实现卵巢肿瘤的靶向治疗。经体内外实验研究表明：D构型多肽修饰的基因载体，可以显著提高基因转染效率，所述基因载体包载治疗基因是Gro-ɑshRNA，可以显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI/pGro-ɑ可以显著抑制裸鼠皮下肿瘤生长。附图说明图1为D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI合成路线图；图2为mPEG-PEI及D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI材料合成1H-NMR图谱；图3为293T细胞及A2780细胞对L-FP21-PP及D-FP21-PP的摄取荧光照片及流式检测结果；图4为D-FP21-PP/pGro-ɑ、L-FP21-PP/pGro-ɑ、mPP/pGro-ɑ及PEI/pGro-ɑ对肿瘤细胞的转染效率；图5为D-FP21-PP/pGro-ɑ、mPP/pGro-ɑ及PEI/pGro-ɑ纳米复合物对靶蛋白Gro-ɑ表达的沉默效果；图6为各治疗组肿瘤生长曲线及体重变化。具体实施方式1）纳米载体材料的合成及1H-NMR结构鉴定定量称取D型多肽D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)与NHS-PEG-MAL使其摩尔比为4:1。DMF充分溶解后室温磁力搅拌进行反应6h后，加入dH2O把反应液稀释5倍终止反应；再将该溶液置于AmiconUltra-4（3KDa）超滤离心管中室温3000rpm离心45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统，其特征在于，将L型多肽YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF逆序以D构型的氨基酸替代后得到

【技术特征摘要】
2016.07.18 CN 20161056296101.一种具有卵巢肿瘤靶向D构型多肽及其基因递释系统，其特征在于，将L型多肽YTRDLVYKDPARPKIQKTCTF逆序以D构型的氨基酸替代后得到D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)序列多肽，作为靶向分子，利用其与FSHR的高亲和性，将基因靶向输送至卵巢癌细胞处；并且，将D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)修饰到PEI-PEG表面制得D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-PEI（D-FP21-PP）基因载体，所述基因载体包载治疗基因Gro-ɑshRNA；所述D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)多肽的N端氨基与含有琥珀酰亚胺-聚乙二醇的阳离子多聚物连接，制得非病毒基因载体材料D(FTCTKQIKPRAPDKYVLDRTY)-PEG-X复合物；该复合物可包载报告基因或治疗基因形成非病毒基因递释系统；其中，该复合物中X是聚乙烯亚胺（PEI）、树枝状聚合物（PAMAM）、多聚阳离子氨基酸、壳聚糖或阳离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丛剑，张晓燕，张梦宇，张明星，蔡青青，尧良清，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31