一种海洋源钙螯合肽及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种海洋源钙螯合肽及其制备方法，以裂殖壶菌粕蛋白为原料，通过碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解，再利用分离纯化得到纯化的特异性金属钙螯合肽，氨基酸全序列为：SSV。本发明专利技术制备的金属螯合肽可用于生产新型的钙补充制剂——钙螯合肽，因其具有独特的螯合体制和转运机制，和易被吸收、安全无副作用、价格低廉、可同时补充氨基酸和微量金属元素，使其必将成为钙补充剂的首选。本发明专利技术为裂殖壶菌粕蛋白的应用提供了一条崭新的思路。

Marine source calcium chelate peptide and preparation method thereof

The present invention provides a source of marine calcium chelating peptide and a preparation method thereof, in Schizochytrium protein meal as raw material, by Alcalase and flavorzyme enzymatic recycling, separation and purification of purified specific calcium metal chelating peptides, amino acid sequence: SSV. Metal chelating peptide prepared by the invention can be used for the production of novel calcium supplements, calcium chelating peptides, because of its unique system of chelating and transport mechanism, and easy to be absorbed, safety and no side effect, low price, can also add amino acids and trace elements, so that it will become the first choice of calcium supplements. The invention provides a new idea for the application of the protein of the fungus dregs fungus.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋源钙螯合肽及其制备方法
本专利技术涉及一种钙螯合肽，更具体地涉及了一种海洋源钙螯合肽及其制备方法，属于生物

技术介绍
目前，钙缺失是全球性的营养问题，缺钙造成机体的各种疾病，使人处于亚健康状态。近几年来，随着补钙试剂迅猛发展，使得国民补钙意识也在不断增加。虽然这些补钙剂能在一定程度上缓解钙缺失的压力，但却也没有从根本上改善国民缺钙的状况，其主要原因是在于钙的生物利用度较低。我国的膳食组成是植物性食物，而植物中的草酸、磷酸和植酸等成分容易在肠道中钙离子结合形成难溶性的草酸盐、磷酸盐和植酸盐，降低了机体内钙的生物利用度。因此，除了开发补钙产品外，提高钙的生物利用度也是解决钙缺失的关键方法之一。随着科学研究的深入，发现多肽-钙螯合物具有独特的螯合体制与转运机制，更易被人体吸收转运，肽钙螯合物结构稳定。机体对肽钙螯合物的吸收是通过肽的吸收通道，从而可以避免与其他被吸收的金属离子的拮抗竞争，提高钙离子的吸收率，提高其生物利用度。由此可见，多肽-金属螯合物的吸收率高，稳定性好，是理想的保健品添加物。随着海洋源活性物质的研究与产品开发的兴起，微藻生物被联合国粮农组织确定为21世纪绿色健康食品，微藻不仅营养成分丰富，而且有优良的医疗保健作用。裂殖壶菌作为优质饵料的微藻源，本身就含有较高的蛋白质，且富含能与钙离子结合的氨基酸残基，因此，从裂殖壶菌粕中提取出蛋白做为原料开发钙螯合肽，能够为钙制剂提供一种有效的载体，既增加了裂殖壶菌蛋白产品的附加值，又能为补钙制品提供了新的思路；因此，如何获得具有钙螯合活性的肽，就成为制备新型微量金属元素补充剂亟需的研究方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种利用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解裂殖壶菌粕蛋白制备的金属螯合肽，使钙螯合活性得以高效地实现。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种金属螯合肽，所述肽的氨基酸序列为：SSV。所述金属为Ca。一种金属螯合肽的制备方法，以裂殖壶菌粕蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶对其进行分步酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。所述的第一步酶解条件为：最适酶为碱性蛋白酶，时间为8h，pH为9，酶底比为10%，底物浓度为1%。所述的第二步酶解条件为：最适酶为复合风味蛋白酶，酶底比为10%，温度为40℃，pH为6，时间为3h50min。所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用SephadexG-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，反相HPLC的分离条件是用体积比为0-40%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为2mL/min，收集洗脱峰，得到所述的金属螯合肽。本专利技术立足于多肽具备与金属离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-金属螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收转运、又能补充氨基酸和金属的理论基础，以来自于海洋源的裂殖壶菌粕蛋白为原材料，经过碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解进行优化，以制备具有高钙螯合活性的肽，而使金属螯合活性得以高效地实现。本专利技术为裂殖壶菌粕蛋白的应用提供了一条崭新的思路。附图说明图1纯化裂殖壶菌粕蛋白源金属螯合肽的RP-HPLC-C18色谱图；其中SPH-2A为该特异性金属螯合肽的色谱峰。具体实施方式实施例1采用的仪器、检测手段如下：本技术所采用的裂殖壶菌粕，由福建省水产研究所提供，酶购自诺维信生物技术有限公司（中国·天津）。首先进行裂殖壶菌粕蛋白的提取，使用中药粉碎机处理裂殖壶菌粕，过60目筛，获得实验用原料。采用碱提酸沉的方法提取裂殖壶菌粕中的蛋白质。配制浓度为0.39mol/L的NaOH溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。将所获得的样液在4℃下以10000r/min的转速离心20min，取上清弃沉淀。再用6mol/LHCl调节上清液中的pH值，调节pH值至3.0，对蛋白质进行酸沉。静置30min后，在4℃下以10000r/min的转速离心20min。最终取沉淀弃上清，冷冻干燥，然后再进一步对其酶解。酶解工艺采用单因素实验，第一步酶解实验分别对五个酶解因素进行考察，分别为最适酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），时间（0.0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h），pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，酶底比（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w），底物浓度（1%、3%、5%、7%、9%，w/v）。在第一步酶解的基础上，第二步酶解实验分别对五个酶解因素进行考察，最适酶（复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），时间（0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h），酶底比（4%、6%、8%、10%、12%，w/w），pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）。称取一定质量裂殖壶菌蛋白溶解于蒸馏水中，然后用2mol/LNaOH将其pH调节至最适pH。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶底比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对金属钙螯合活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到第二步酶解中具有最大金属螯合活性的酶解液的酶解条件是：酶底比10%、温度40℃、pH6、时间3h50min。本专利技术的制备金属螯合肽的钙螯合活性测定方法，采用邻-甲酚酞比色法，测定金属螯合肽对钙离子的螯合作用。将1mL5mmol/L的CaCl2和2mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH8.0）加入具塞试管中，再加入1mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃温育2h，取出后10000r/min常温离心10min。取1mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5mL，摇匀。放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。标准曲线的制作：分别取标准Ca工作液（10ug/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL试管中，分别加去离子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL，加入邻-甲酚酞显色液5mL，摇匀，放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值。以可溶性钙含量（ug/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y=0.0992x-0.0887，R²=0.9988。应用SephadexG-25分子筛、RP-HPLC反相高效液相色谱等分离纯化手段，实现显著活性的裂殖壶菌粕蛋白金属螯合肽的高效分离纯化。称取1.0克裂殖壶菌粕蛋白溶解于100ml蒸馏水中→用2mol/LNaOH调节pH至9.0→加碱性蛋白酶→立即置于50℃的水浴摇床中反应8h→沸水浴灭酶10min→立即冷却→10000r/min离心10min，取上清→粗酶解液→用2mol/LNaOH调节pH至6.0→加复合风味蛋白酶→立即置于40℃的水浴摇床中反应3h50min→沸水浴灭酶10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋源金属螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：SSV。

【技术特征摘要】
1.一种海洋源金属螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：SSV。2.根据权利要求1所述的一种金属螯合肽，其特征在于：所述金属为Ca。3.一种如权利要求1所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：以海洋裂殖壶菌粕蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶对其进行分步酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。4.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：所述的第一步酶解条件为：最适酶为碱性蛋白酶，时间为8h，pH为9，酶底比为10%，底物浓度为1%；所述的第二步酶解条件为：最适酶为复合风味蛋白酶，酶底比为10%，温度为40℃，pH为6，时间为3h50min。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪少芸，颜阿娜，徐梁棕，谢晓丽，蔡茜茜，陈旭，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35