黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：1)、选用黄精叶钩吻的根状茎的不定芽作为外植体；2)、不定芽的消毒；3)、不定芽的启动培养：将消毒后的不定芽剥离外围的叶片后接种到启动培养基上，进行不定芽生长及丛生芽的诱导；4)、不定芽的快速扩增：将步骤3)所得的丛生芽分割成含1新芽的芽丛后转接于增殖培养基上进行培养；5)、不定芽的伸长及生根培养：将步骤4)所得的丛生芽切割成含2～3株为一丛的不定芽丛转移到生根/伸长培养基上进行培养；6)、将步骤5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶种植的种苗。

Tissue culture and rapid propagation method of Polygonatum leaf hemlock

The present invention discloses a kind of tissue culture of Polygonatum maculatum rapid breeding method, which comprises the following steps: 1), the Ye Gouwen Polygonatum rhizomes of adventitious buds as explants; 2), disinfection of adventitious buds; 3), adventitious bud initiation culture: leaves after disinfection of adventitious buds from the outer peel about to start after the inoculation medium, adventitious buds growth and bud induction; 4), rapid amplification of adventitious buds: Step 3) the bud bud is divided into containing 1 buds after switching to the proliferation medium for culture; 5), and rooting culture of adventitious buds elongation: Step 4) the bud cut with 2 ~ 3 were a cluster of adventitious buds elongation / transferred to rooting culture medium; 6), step 5) the rooting plants have been removed, it can be a bottle of planting seedlings.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法。
技术介绍
植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。植物合成和积累的次生代谢物被广泛应用于药品、食品和化妆品等行业。我国是世界上药用植物资源最丰富的国家之一，随着中医药产业的快速发展，国内、外对中药资源的需求在迅速增加，我国每年也有大量来源于药用植物的提取物出口到世界各地，这些都加速着我国中药资源的消耗，给濒危的药用植物资源带来毁灭性的危害(陈士林&肖培根，2006；高文远&肖培根，2008)。工业化加上城市化也不断地增加自然资源的压力。由于生态环境的破坏和掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含量下降，甚至耗竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦，2001)。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。在快速繁殖、保护和增强有用的次级代谢物的水平以满足药物的需求并减少原位采收自然资源方面，植物组织培养技术拥有巨大的潜力(Bapat等，2008)。黄精叶钩吻属(Croomia)植物是百部科(Stemonaceae)多年生草本植物，花部4基数，属单子叶植物网状脉类群。该属仅6个种，4种(C.heterosepala,C.hyugaensis,C.saitoana和C.kinoshitae)为日本特有(Kato&Ebihara,2011；Kadota,2010，2012)，1种(C.japonica)为中国和日本分布，1种(C.pauciflora)为美国特有。该属植物的总体分布呈古老的东亚-北美间断分布，在亚洲又呈现为中国大陆-日本岛屿的分布格局。该属植物的染色体研究表明该属的3个种(C.heterosepala，C.japonica和C.pauciflora)染色体数目都是2n＝24(Duyfjes,1991；Oginuma等,2001)，但也有研究指出黄精叶钩吻(C.japonica)的染色体数目为2n＝26(李林初，1986)。李恩香(2006)的研究表明该属植物的繁育系统为自交可育的混合交配系统。叶绿体DNA(trnL一F)的研究表明：东亚的两个种是姐妹类群，分歧时间是在更新世中晚期；东亚种与美国种的分歧时间是在上新世晚期到更新世早期(Li等，2008)。方明(2012)基于SSR分子标记和单拷贝核基因Agtl序列研究表明黄精叶钩吻是祖先种，并由它衍生出了日本的C.heterosepala和北美的C.pauciflora。中国的天目山可能是该属植物的分布及起源中心。黄精叶钩吻属植物是一类种群较小且区域化分布的种，种群的繁殖和散布主要依赖根茎的无性繁殖。由于根茎的活动非常有限，使该属植物成为易受干扰、易濒危的植物(Tomlinson和Ayensu,1968)。因此，该属植物在中国、日本和美国都被列为稀有濒危植物名录(傅立国，1992；Estill&Cruzan,2001；Chafin，2007；Kato&Ebihara,2011)。黄精叶钩吻，又名金刚大，分布于我国浙江、安徽、江西、福建和日本。该植物的根状茎是民间常用的药物，具有祛风解毒、治跌打损、毒蛇咬伤等功效(浙江植物志，1994)。林文翰等(1993)对金刚大的根部和茎叶的化学成分的研究表明其主要成分为金刚大碱(Croomine)和脱氢金刚大碱((didehydrocroomine)，另外根部还有粉蕊黄杨胺A(pachysamineA)和金刚大啶(Croomionidine)两个甾体生物碱和β-谷甾醇。。黄精叶钩吻种群间遗传分化高，而种群内的遗传多样性低(li等，2008)，同时由于种群较小、受人类活动影响严重的，因此亟待保护。由于该种植物的结实率较低，因此通过种子发芽的繁殖方式有限，通过根茎的繁殖是其野外繁殖的主要方式，但该方法也很有限。因此，发展和利用离体快繁的方法势在必行。为了保护野生的黄精叶钩吻资源，同时又能满足医药工业的应用，因此有必要建立黄精叶钩吻的离体再生体系，这对丰富植物组织培养的理论和应用生物技术保护种质资源以及满足临床应用等均有重要意义。迄今为止，国内外关于黄精叶钩吻组织培养方面的研究还是有限的和初步的，仅仅是利用黄精叶钩吻的茎段诱导出愈伤组织和防止愈伤组织褐化的研究(李温平等，2012；陈贝贝等，2012)，未见愈伤组织成功分化出试管苗的报道。涉及的参考文献具体如下：1、BapatVA,YadavSR,DixitGB.Rescueofendangeredplantsthroughbiotechnologicalapplications[J].NationalAcademyScienceLetters,2008,31(7&8):201-211(BapatVA,YadavSR,DixitGB.通过生物技术挽救濒危植物[J].国家科学院科学通讯，2008,31(7&8):201-211)；2、ChafinLG.FieldguidetotherareplantsofGeorgia[M].UniversityofGeorgiaPress,2007.(ChafinLG.佐治亚州珍稀植物野外指南[M].佐治亚大学出版社，2007.)；3、DuyfjesB.E.E.StemonaceaeandPentastemonaceae；withmiscellaneousnotesonmembersofbothfamilies[J].Blumea,1991,36:239-252.(百部科和鳞百部科：这两个科成员的多种多样的注释[J].Blumea,1991,36:239-252.)；4、EstillJC，CruzanMB.PhytogeographyofrareplantspeciesendemictotheSoutheasternUnitedStates[J].Castanea,2001,66(1-2):3-23.(EstillJC，CruzanMB.美国东南部特有、珍稀植物的植物地理学研究[J].Castanea,2001,66(1-2):3-23.)；5、KatoM&EbiharaA.EndemicplantsofJapan[M].TokaiUniversityPress,2011.(KatoM&EbiharaA.日本的特有植物[M].东海大学出版社,2011.)；6、KadotaY.TwonewspeciesofCroomia(Stemonaceae)frommiyazakiprefecture,kyushusouthernJapan[J].TheJournalofJapaneseBotany,2010,85(5):277-288.(KadotaY.日本九州南部宫崎县2个黄精叶钩吻属新种[J].日本植物学杂志,2010,85(5):277-288.)；7、KadotaY.ThenewspeciesofCroomia(Stemonaceae)fromshikoku,westernJapan[J].TheJournalofJapaneseBotany,2012,87:79-84.(KadotaY.日本西部—四国,黄精叶钩吻属一个新种[J].日本植物学杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，其特征是包括以下步骤：1)、取材：选用黄精叶钩吻的根状茎的不定芽作为外植体；2)、不定芽的消毒：将步骤1)所得的根状茎上的不定芽充分洗涤，然后在超净台上操作，先用75％酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％升汞灭菌8～10min，无菌水冲洗3～5次；3)、不定芽的启动培养：将消毒后的不定芽剥离外围的叶片后接种到启动培养基上，进行不定芽生长及丛生芽的诱导；所述启动培养基为MS+BA0.6～3mg/L+NAA0～0.2mg/L+蔗糖20～30g/l+琼脂5～8g/l，pH为5.6～5.8；诱导培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm‑2s‑1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；当启动培养基上的不定芽的基部出现至少3个丛生芽时，结束启动培养；4)、不定芽的快速扩增：将步骤3)所得的丛生芽分割成含1新芽的芽丛后转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为MS+BA 0.6～3mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+KT 0～1.0mg/L+2,4‑D 0～0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm‑2s‑1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；待增殖培养基上的新芽至少长出3个丛生芽时，结束此步骤的培养；5)、不定芽的伸长及生根培养：将步骤4)所得的丛生芽切割成含2～3株为一丛的不定芽丛转移到生根/伸长培养基上进行培养，生根/伸长培养基为MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmoLm‑2s‑1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为20±1℃；上述光照和暗培养交替进行；当不定芽丛长到4.0～6.0cm高、且基部有至少5条根时，结束此步骤的培养；6)、将步骤5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶种植的种苗。...

【技术特征摘要】
1.黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，其特征是包括以下步骤：1)、取材：选用黄精叶钩吻的根状茎的不定芽作为外植体；2)、不定芽的消毒：将步骤1)所得的根状茎上的不定芽充分洗涤，然后在超净台上操作，先用75％酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％升汞灭菌8～10min，无菌水冲洗3～5次；3)、不定芽的启动培养：将消毒后的不定芽剥离外围的叶片后接种到启动培养基上，进行不定芽生长及丛生芽的诱导；所述启动培养基为MS+BA0.6～3mg/L+NAA0～0.2mg/L+蔗糖20～30g/l+琼脂5～8g/l，pH为5.6～5.8；诱导培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm-2s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；当启动培养基上的不定芽的基部出现至少3个丛生芽时，结束启动培养；4)、不定芽的快速扩增：将步骤3)所得的丛生芽分割成含1新芽的芽丛后转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为MS+BA0.6～3mg/L+NAA0.2～0.5mg/L+KT0～1.0mg/L+2,4-D0～0.5mg/L+0.8g/LPVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm-2s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；待增殖培养基上的新芽至少长出3个丛生芽时，结束此步骤的培养；5)、不定芽的伸长及生根培养：将步骤4)所得的丛生芽切割成含2～3株为一丛的不定芽丛转移到生根/伸长培养基上进行培养，生根/伸长培养基为MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/LPVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmoLm-2s-1，温度为25±1℃；...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜维梅，邱英雄，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33