在核酸固相上的吸附制造技术

本发明专利技术涉及一种利用两步法将核酸吸附，也就是非共价键连接至固相上的方法。更进一步，本发明专利技术涉及一种从生物样品中分离核酸的方法。在该方法的第一步中，通过将生物样品与含有离液剂的水性裂解缓冲溶液混合并且温育混合物来进行裂解；在第二步中，增加混合物中离液剂的浓度并将混合物与固相接触，由此将液相中的核酸吸附到固相上。

【技术实现步骤摘要】
专利说明在核酸固相上的吸附 本专利技术涉及一种将核酸吸附，也就是以非共价键方式连接至固相上的方法。更进一步，本专利技术涉及一种从生物样品中分离核酸的方法。 许多生物物质，尤其是核酸，在将其从它们所存在的自然环境中分离出来时特别的困难。一方面，它们的浓度通常都很低，另一方面，它们经常包含在许多其他的固体物质和溶解物，例如细胞裂解物中。这使得它们难以被分离或测定，特别是在针对特定的核酸检测或核酸的特异性检测的生物特异性试验中。这些生物特异性试验在研发中的诊断学以及生物分析学领域起着重要的作用。生物特异性试验的例子有杂交试验、免疫试验和受体-配体试验。杂交试验利用特异性的碱基配对来对核酸分析物例如RNA和DNA进行分子检测。此时，18至20个核苷酸长度的寡核苷酸探针就能够特异性地识别所选择的互补序列，例如在人类基因组中的序列。另一个需要两个寡核苷酸引物选择性结合的试验是US4683195中所描述的聚合酶链式反应(PCR)。这种方法允许在脱氧核苷三磷酸存在时通过热稳定性聚合酶在儿个循环后将特定的核酸区域选择性地扩增至可检测水平。 如上所述，在核酸可以用上述试验之一进行分析或用于其它程序之前，必须将它们从生物样品中，从含有不同成分例如蛋白质和非蛋白质成分的复杂混合物中分离或纯化出来。通常第一步是将感兴趣的成分，例如核酸，进行富集。这些成分经常包含在细菌的细胞、真菌细胞、病毒颗粒、或一个更复杂的生物体的细胞，例如人血细胞或植物细胞中。核酸作为一种感兴趣的成分也可以被称为“目标成分”。 可以用酶或化学物质处理所述的细胞或颗粒，以使这些组织的细胞壁和细胞膜溶解、降解或变性来释放内容物。该步骤通常被称为裂解。所得到的含有裂解的物质的溶液称为细胞裂解液。在细胞裂解中经常遇到的一个问题是其它的酶会降解目标成分，例如可降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶，在细胞裂解过程中它们与目标成分接触而降解核酸。这些降解酶在细胞裂解前就可能存在于细胞外或细胞空间内不同的区室中，而此时得以与目标成分接触。在这个过程中另一些成分可能被释放，例如属于脂多糖家族的内毒素，它对细胞是有毒的，并可能使计划用于人或动物治疗用途的产品产生问题。 在细胞裂解步骤后接下来的样品制备步骤中，核酸被进一步富集。核酸在被用于基于探针的试验前，通常要从复杂的细胞裂解混合物中提取出来。有几种核酸提取的方法。序列依赖性的或生物特异性的方法包括例如亲和层析或与固定化的探针进行杂交。非序列依赖性的或物理化学的方法包括了例如，采用苯酚—氯仿进行的液相—液相抽提、用纯乙醇或异丙醇沉淀、用滤纸提取、用胶束形成剂如十六烷基三甲基溴化铵提取、与固定化的嵌入染料如吖啶类衍生物结合、吸附于基质如硅胶或硅藻土上、在离液序列高的条件下吸附于可磁性吸引的玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒上。优选核酸与一种基质例如具有硅石表面的材料直接结合，因为除非其他原因，核酸不必被修饰，甚至天然的核酸也可以被结合。 虽然其他表面也可以吸附核酸，但玻璃表面对核酸的吸附更有利于达到分离的目的。 通过细胞裂解和/或细胞器如线粒体、质体、细胞核或其他含有核酸的细胞器的裂解所释放的核酸，可通过与固相比如无机基质结合，洗涤所述结合有核酸的无机基质并从所述的无机基质上释放所述核酸的方式而得以纯化。 在离液序列高的盐存在的条件下，玻璃颗粒或硅石颗粒吸附核酸是本领域公知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)并为核酸的层析纯化及分离工艺提供了基础。利用高浓度的离液序列高的盐，例如碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸胍从细胞裂解液中分离纯化RNA和DNA的方法也是本领域的公知技术(Boom，R.等，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。Marko，M.A.等在Anal.Biochem.121(1982) 382-387中描述了在高氯酸钠存在时利用玻璃粉从细菌中纯化质粒DNA。DE3724442中描述了通过醋酸沉淀噬菌体颗粒并通过高氯酸盐裂解噬菌体颗粒，然后利用玻璃纤维滤器分离单链M13噬菌体DNA的方法。在将结合于玻璃纤维滤器上的核酸洗涤后，用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液进行洗脱。Jakobi，R等在Anal.Biochem.175(1988)196-201中描述了一个类似的从λ噬菌体中纯化DNA的方法。该方法需要使核酸在高氯酸盐溶液中选择性地与玻璃表面结合并使得核酸与污染物例如琼脂糖、蛋白质或细胞碎片分离。为了使玻璃颗粒与污染物分离，可以对玻璃颗粒进行离心或将液体倒入玻璃纤维滤器中进行分离。但是该步骤有局限性，它不能用于大量样品的处理。 在加入盐和乙醇进行沉淀后，用磁性颗粒来固定核酸更为有利，这一方法在如Alderton，R.P.等，Anal.Biochem.201(1992)166-169及WO9100212中有所描述。在这一方法中，将核酸粘着于磁性颗粒上。通过施加磁场及洗涤步骤就可将粘着物与原溶液分离。经过一次洗涤后，将核酸溶解到Tris缓冲液中。但是这个方法还存在缺点，其中的沉淀过程对于核酸来说是不具有选择性的，而是还粘着许多固体及溶解物。因此，这种方法不能用来除去任何可能存在的有效量的特定酶反应的抑制因子。磁性的多孔玻璃也可以在市场上买到，它在多孔的、特殊的玻璃基质中含有磁性颗粒并覆盖有一层链霉亲和素膜。如果通过复杂的制备步骤将其修饰使之能与生物素以共价键结合，该产品就可用于生物物质，例如蛋白质或核酸的分离。可磁化的特殊吸附剂已被证明适用于自动样品制备且是非常高效的。亚铁磁性的和铁磁性的以及超顺磁性的色素也被用于此目的。最优选的MGPs在WO0137291中有所描述。 通过在高盐浓度下将核酸吸附于某种基质如无机基质来纯化核酸的方法也被用于其他复杂的混合物中。而这些例子对于分子生物学领域的技术人员来说都是已知的，而且还包括下述在例如核酸的体外合成如PCR、限制酶消化、连接反应等之后的反应混合物。例如在Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中提出了一种在碘化钠存在时将琼脂糖凝胶中的核酸结合到碎燧石玻璃上的方法。通过在高盐浓度下将核酸吸附于某种基质如无机基质上来纯化核酸的方法的另一种用途是除去可与核酸共纯化的热原污染物。 在高盐浓度下核酸吸附于无机基质上的原理还不完全清楚。据推测核酸与溶剂之间的相互作用受到影响使得核酸吸附于无机基质上并产生变性。在高浓度离液剂存在的情况下这一反应几乎是定量的。被吸附的核酸可以通过在无机基质上施加低离子强度的缓冲液进行洗脱。 US5808041中公开了从某些生物样品中分离长度在50个碱基以上的核酸的方法。制备一种所含的离液序列高的离子浓度大约在2M以上的裂解水溶液，并将核酸从裂解液中吸附到硅石材料上(也指“结合”)。将一种含有硅石材料的泥浆或树脂及离液序列高的盐加入到生物材料中，从而使裂解过程和结合过程在一步中实现。该文献中所公开的裂解生物样品的方法包括利用碱金属氢氧化物和SDS裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将生物样品中的核酸吸附到固相上的方法，包括以下步骤：（ａ）提供含有离液剂的水性裂解缓冲溶液；（ｂ）将该裂解缓冲液与生物样品混合，从而使混合物中离液剂的浓度在１Ｍ至４Ｍ之间，并孵育混合物；（ｃ）向步骤（ｂ）的混合物 中溶入额外量的离液剂或加入含有额外的离液剂的水溶液，从而将混合物中离液剂的浓度提高０．５Ｍ以上；（ｄ）将步骤（ｃ）的混合物与固相接触，从而使混合物中的核酸吸附到固相上。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：R齐伦斯基，K盖斯勒，T瓦尔特尔，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]