本发明专利技术公开了一种利用匀浆器研磨凝胶快速高效纯化回收小片段ＤＮＡ的方法。将包含目的小片段ＤＮＡ的凝胶在ＴＥ缓冲液中直接用匀浆器研磨后，离心收集上清，在盐离子和无水乙醇的作用下沉淀ＤＮＡ，再将沉淀的ＤＮＡ重溶于ＴＥ缓冲液中，从而实现小片段ＤＮＡ的高效纯化回收。该方法操作步骤简单，提高了回收效率。该方法同时为基因克隆、突变检测、基因诊断和治疗等研究和应用中小分子量ＤＮＡ的纯化回收提供了一种新的手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段 DNA的方法和用途。
技术介绍
分离纯化DNA是基因工程领域中的一项基本技术，目前，DNA回收的主 要方法是通过凝胶电泳分离DNA片段，然后切割含有目的片段的凝胶，在NaI 的作用下溶解凝胶，然后过柱或玻璃株回收DNA。该方法对分离分子量DNA 是非常有效的，然而，DNA的回收得率是和DNA的分子量相关的，当DNA的 分子量在合适的范围时可以得到很高的回收率；当分子量大于20kb时，回收率 只有20。/^左右，同样的对于小分子量DNA,其回收效率也是很低的，尤其是分 子量少于100bp的片段，甚至不能得到目的片段，不能满足常规实验的要求。目前有多家生物公司开发了可用于回收DNA的试剂盒，这些试剂盒对一般 分子量大小的DNA是有效的，但因自身缺陷而对于小分子量DNA回收效率低 下，甚至不能得到目的片段。本专利技术提供了一种高得率小分子量DNA的回收方 法，该方法尤其适合于回收分子量低于100 bp的DNA片段，而且对大分子量 DNA的回收同样有效。同时该方法可用于回收PCR产物、小片段DNA或小分 子量肽，以及用于提高表达产量而构建的多基因串连产物。
技术实现思路
本专利技术针对现有对小分子量DNA回收技术的缺陷，提供一种用研磨法从凝 胶中高效纯化小片段DNA的方法和用途。利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法包括如下步骤-1) 在回收包含PCR或酶切产生的小分子量DNA片段的高浓度凝胶中，加 入400 800 u10.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000 12000 rpm离心5 10分钟，取上清；2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 10000 12000rpm离心5 10分钟， 弃上清；3) 用600 1000 lU 70X的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000 12000 rpm离心3 5分钟，弃上清；4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。 所述的小分子量DNA片段小于100 bp。纯化的小分子量DNA用于克隆、转化、转染、DNA疫苗接种和/或PCR反应。本专利技术具有如下优点1. 本专利技术凝胶磨碎采用匀桨器，免去了酚/氯仿等有害物质的污染；2. 与其他类似的DNA纯化试剂盒相比，本专利技术可以有效的从凝胶中纯化分 子量低于100bp的DNA片段，提高了小分子量DNA的回收效率，同样，本发 明也可有效的回收分子量大于100bp的DNA片段；3. 本专利技术为需要回收小分子量DNA的克隆、转化、基因转导、突变检测、 基因诊断和治疗等研究和应用提供了一种新的手段和方法。附图说明图1为DNA的凝胶电泳图，是本专利技术所用方法与其他公司试剂盒纯化DNA 之间的比较；图中泳道l、 2、 3为试剂盒纯化DNA，分子量分别为72 、 98、 225 bp;泳道4为50 bpDNA分子量Marker;泳道5、 6、 7为本专利技术方法纯化分 子量为72 、 98、 225bpDNA。与参考DNA相比由本方法纯化的小分子量DNA得率明显高于对照。显然，本 方法与其他试剂盒提取DNA相比，显著提高了纯化效率。图2为本专利技术纯化的DNA进行常规连接、转化后挑取单克隆进行PCR鉴 定的凝胶电泳图；图中泳道1为50 bpDNA分子量Marker;泳道2、 3、 4为 分子量为72 、 98、 225bp的PCR产物。 具体实施例方式本专利技术以匀浆器研磨破碎电泳结束后切割的带有目的条带的凝胶，使凝胶 中的小分子量DNA释放到缓冲液中，在离心力的作用下实现DNA与凝胶的分 离；在通过盐离子和有机溶剂的作用使DNA沉淀下来，从而实现对小分子量 DNA的高效纯化，建立一种新的基于匀浆器研磨的小分子量DNA的快速高效 纯化方法。实施例11) 在回收包含70bpDNAPCR产物的高浓度凝胶中，加入400 ul 0.1倍 TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000 rpm离心10分钟，取上清;2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 10000 rpm离心10分钟，弃上清；43) 用600 u 1 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000 rpm离心5分钟，弃上清；4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 "C保存。取5ul电泳结果如图l所示。实施例21) 在回收包含98 bp DNA PCR产物的高浓度凝胶中，加入800 y 1 0.1倍 TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，12000卬m离心5分钟，取上清；2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA;12000rpm离心5分钟，弃上清；3 )用1000 U 1 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，12000 rpm离心3分钟，弃 上清；4)真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。取5ul电泳结果如图l所示。 实施例31) 在回收包含酶切产生的225bpDNA片段的高浓度凝胶中，加入600 ul 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，11000 rpm离心6分钟，取上清；2) 在上清液中加入l/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇， 或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA; 11000rpm离心6分钟，弃上清；3) 用800 lU 70%的冷乙醇洗涤DNA沉淀，11000 rpm离心6分钟，弃上清；4) 真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在O.l 倍TE缓冲液或灭菌水中，-20 'C保存。取5ul电泳结果如图l所示。实施例4将纯化的70， 98和225bp的DNA片段1. PCR扩增约不同长度的DNA片段150 !U，取IOO u 1等分两个加样孔中 电泳，切下扩增片段；2. 参照试剂盒说明书对一份DNA样品进行纯化，最后溶在30 li 1的0.1 X TE缓冲液中；将另外的一份样品放在匀桨器中，采用本专利技术所述的方法进行纯 化，最后同样溶在30 Pl的0.1XTE缓冲液中；3. 将纯化的30 ulDNA样品分别取5 "1进行2。％浓度的凝胶电泳，紫外 灯下观察电泳DNA条带的明亮程度并进行密度扫描；4. 将本方法纯化的DNA进行常规生物学操作，并对连接产物进行PCR鉴定。权利要求1.一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法，其特征在于包括如下步骤1)在回收包含PCR或酶切产生的小分子量DNA片段的高浓度凝胶中，加入400～800μl 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000～12000rpm离心5～10分钟，取上清；2)在上清液中加入1/3体积pH为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇，或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA；10000～12000rpm离心5～10分钟，弃上清；3)用600～1000μl 7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段ＤＮＡ的方法，其特征在于包括如下步骤：１）在回收包含ＰＣＲ或酶切产生的小分子量ＤＮＡ片段的高浓度凝胶中，加入４００～８００μｌ０．１倍ＴＥ缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，１００００～１２０００ｒｐｍ 离心５～１０分钟，取上清；２）在上清液中加入１／３体积ｐＨ为５．２的３ＭＮａＡｃ和２倍体积的无水乙醇，或者０．６倍体积的异丙醇，以沉淀ＤＮＡ；１００００～１２０００ｒｐｍ离心５～１０分钟，弃上清；３）用６００～１０００μ ｌ７０％的冷乙醇洗涤ＤＮＡ沉淀，１００００～１２０００ｒｐｍ离心３～５分钟，弃上清；４）真空抽干ＤＮＡ沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将ＤＮＡ沉淀溶解在０．１倍ＴＥ缓冲液或灭菌水中，－２０℃保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林旭瑷，陈寅，严杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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