可脱保护的硫代核苷酸单体制造技术

可脱保护的硫代核苷酸单体涉及到化学基团修饰的硫代核苷或核苷酸分子，修饰硫代核苷或核苷酸分子的化学基团在一定条件下能够转变成羟基，并能被用于多聚核苷酸序列的分析，该硫代核苷或硫代核苷酸单体分子结构如上，其中：上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由碱基基团Ｙ、核糖或脱氧核糖基团和硫代三磷酸根基团构成；核糖或脱氧核糖基团２′和３′位置上连接着Ｒ１和Ｒ２基团，Ｒ１或Ｒ２基团可以被分解，形成羟基。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到化学基团修饰的硫代核苷或核苷酸分子，修饰硫代核苷或核苷酸 分子的化学基团在一定条件下能够转变成羟基，并能被用于多聚核苷酸序列的分 析，属于生物
技术背景在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一歩研究和改造目的基因的基础。 目前用于最为广泛应用的测序技术是Sanger等(1977)专利技术的双脱氧链末端终止 法，Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上 的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反 应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不 同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延 长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、 T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧 而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几 千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可 通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射 自显影或非同位素标记进行检测。目前，人类基因组序列30亿碱基的测序工作已 经完成，已识别出一批重要的人类疾病相关的基因。此外，很多的模式生物以及 细菌、古细菌、支原体和酵母等全基因组的测序己经完成。Sanger法的优势在于 可以分析未知的DNA序列，而且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到 1000bp以上，然后，在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序 列验证或是对为数不多的位点进行分析验证，在这种情况下，较短序列的高通量 测序方法更为适用。测序技术可以在多个领域进行应用，在分子诊断学方面，可以用于病原微生物的快速鉴定，遗传病分子诊断(如SNPs， SNP等位频率)，在法医鉴定方面，如对 线粒体D-Loop区的HVI和HVII高可变区进行分析，在药物基因组学方面，如瑞 典EuronaMedical AB与Pyrosequencing公司合作对血管紧张转换酶(ACE)的SNP 进行分析以及在农业生物方面都有诸多应用。测序技术的发展与出现，是建立在测序试剂发展的基础上的，从最初的放射性 同位素标记的双脱氧核糖核苷酸，进而发展到单色荧光标记的双脱氧核糖核苷酸， 以及四色荧光标记的双脱氧核糖核苷酸，到现在的可脱保护的四色荧光标记的双 脱氧核糖核苷酸。测序试剂的发展推动着新的测序技术的出现，为新测序技术提 供了高速度、低成本和高通量的技术途径.
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种可脱保护的硫代核苷酸单体，为新的测 序技术所能利用的测序试剂，为新测序技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。技术方案本专利技术以预制的硫代核苷或核苷酸单体为基本原料，利用优化的化学合成途径用取代基对核糖或脱氧核糖基团2'和3'位置上的原子进行取代，所得修饰的核苷或核苷酸可被应用于新测序技术以及相关
，所述修饰的核 苷酸具有以下基本结构-<formula>formula see original document page 5</formula>其中上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由碱基基团Y、核糖或脱氧核糖基团和 硫代三磷酸根基团构成;核糖或脱氧核糖基团2'和3'位置上连接着Rl和R2基团， Rl或R2基团可以被分解,形成羟基。其中碱基基团是嘌呤(purine)或者嘧啶(pyrimidine)，三磷酸根基团是硫 代三磷酸根基团。所述的R1和R2可以是相同的基团，也可以是不同的基团，Rl 和R2可以是但不限于是以下的基团H， 0H，羰基，<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>Rfi所述的R4， R5和R6分别是R4可以是氢原子或烃基；R5可以是氢原子或烃 基；R6可以是烃基，环烃基，链烯基，环烯基或苄基。制备的是核苷或核苷酸分子，该分子由碱基基团和核糖或脱氧核糖基团构成， 核糖或脱氧核糖基团2'和3'位置上连接着R1和R2基团，在一定条件下，Rl或 R2基团可以被分解，形成羟基(一OH)。所述的碱基基团是嘌呤(purine)或者嘧 啶(pyrimidine)。所述的嘌呤是氮杂嘌呤(deazapurine)。所述的X是氢原子， 磷酸根基团，二磷酸根基团或三磷酸根基团。所述的三磷酸根基团是硫代三磷酸 根基团。所述的R1和R2可以是相同的基团，也可以是不同的基团。所述的R4， R5和R6分别是R4可以是氢原子或烃基；R5可以是氢原子或烃基；R6可以是烃 基，环烃基，链烯基，环烯基或苄基。以下三类取代基修饰的脱氧核糖核苷酸是本专利技术的优选化合物<formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula>有益效果本专利技术与现有技术相比，具有如下优点本专利技术的最大优点是降低测序成本。现有的测序核苷酸试剂，特别是相同或 相似测序方法的技术中所用的测序试剂通常都是需要两种化学修饰，因此合成产 率很低，导致这一类试剂价格很高，本专利技术对核苷酸进行一种修饰，产率相对较 高，因此，合成成本较低。本专利技术是应用广泛，适合多种测序方法，而这些测序方法可以在医药、医疗、 农业生产以及生命科学研究等多个方面应用。具体实施方式实例1:优选化合物HCW-2的化学合成lmmol硫代三磷酸脱氧核糖核苷酸，27mmol NaOH和0. 4mol溴丙烯在12mL 苯种混合，回流5小时后，停止反应，滤去固体物质，将滤液浓縮得到物质溶于 50mL 3XCCl3C00H/氯仿溶液中，搅拌一分钟后，用饱和NaHCO:,溶液中和，分出有 机相，水相以氯仿萃取多次后合并，无水Na2S04干燥，蒸干溶液后得黄色泡装物 2.45克，得率为85%。实例2:优选化合物HCW-3的化学合成将4.8克硫代三磷酸脱氧核糖核苷酸溶于无水丙腈，共蒸发后，再溶于85mL 无水二氯甲垸中。再将8.92克JH丁基氰基乙基-N,N-二异丙基磷酰胺 (n-butylcyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramidite)力口入至U上述溶液中。经过剧烈振荡混匀后，加入1.92克四氮唑(Tetrazole)，搅拌10小时。反应 混合物在盐冰浴中(-10。C)冷却后，缓慢加入10mL叔丁基氢过氧化物 (t-butylhydroperoxide)的癸烷溶液(4 5Mol)。反应2 3小时后，将反应混 合物转入分液漏斗，并用50mL含5%二硫化钠的二氯甲烷洗涤两次，再用50mL 饱和氯化钠洗涤一次。待乳浊液分层后，分离并保留有机相，用旋转真空干燥仪 挥发二氯甲烷。用3X25mL乙醚洗潘癸垸，洗涤之后小心去掉上层乙醚，将油相 溶于12.5mL二氯甲烷中，并加入125mL乙醚，静置15本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可脱保护的硫代核苷酸单体，其特征在于该硫代核苷或硫代核苷酸单体分子结构为：　　　　＊＊＊　　　　其中：上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由碱基基团Ｙ、核糖或脱氧核糖基团和硫代三磷酸根基团构成；核糖或脱氧核糖基团２′和３′位置上连接着Ｒ１和Ｒ２基团，Ｒ１或Ｒ２基团可以被分解，形成羟基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆祖宏，罗俊峰，肖鹏峰，孙蓓丽，贾超，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]