本发明专利技术属于生物制药及分子生物学技术领域，包括用知母水提物给小鼠灌胃的方法，发现能够通过特异性抑制解偶联蛋白２（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＵＣＰ２）的表达，从而治疗胰岛素抵抗。本发明专利技术将知母经过水煎煮，用旋转蒸发仪浓缩以及减压冻干，得到晶体状浓缩提取物。用该提取物配置成一定浓度的水溶液给小鼠灌胃，发现能够显著的抑制小鼠肾脏中ＵＣＰ２的表达。本发明专利技术阐明了知母水提物能够特异抑制ＵＣＰ２蛋白在肾脏中的表达，可开发为改善和治疗胰岛素抵抗的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药及分子生物学
二、技术背景胰岛素抵抗是指靶细胞对胰岛素的敏感性下降，需要更多的胰岛素才能维护正常的血糖浓度，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍。发病早期胰腺β细胞可以代尝性地增加胰岛素的分泌量以弥补其效应不足，但随着胰岛β细胞功能的逐步衰竭，即代偿机制的丧失，就会表现出胰岛素抵抗，高胰岛素症，高血糖等继而引发糖尿病。现代医学表明，胰岛素抵抗是众多心血管疾病及糖尿病的共同危险因素，会引起多种代谢相关疾病。UCP2是胰岛素分泌的负调节分子。它介导了线粒体内膜的质子渗漏，这已被一系列的研究所证明，这些研究的对象涵盖了原脂质体、线粒体以及完整细胞(Krauss S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.99118-122，2002)。在胰岛β细胞中，UCP2介导的质子渗漏使得糖生成的ATP数量降低，从而负调节胰岛素分泌。ob/ob小鼠是肥胖导致的糖尿病动物模型，在该小鼠胰岛中，UCP2表达显著升高。另外，高血糖也能导致胰岛内UCP2表达升高。更重要的是，在ob/ob小鼠中敲除UCP2，胰岛素分泌的第一相能得到恢复，并且血清中胰岛素含量升高，高血糖症状也得到改善(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)。这些结果充分说明，UCP2在高血糖以及肥胖导致的胰岛功能异常中发挥了重要作用。因此，设法抑制UCP2在的表达在制备改善胰岛素抵抗的药物中具有广阔的前景。知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides)的干燥根茎，具有滋阴降火，润燥滑肠的功效，临床为多味治疗消渴症方剂的君药；中医讲究“阴阳调和”，认为疾病是由于寒热失调所引起的，然而这些理论过于虚幻，缺少现代分子生物学研究支持。因此，我们以知母提取物为研究对象，充分运用分子生物学的实验手段证实了知母可以通过抑制UCP2的表达从而改善胰岛素抵抗的目的，为改善并治疗胰岛素抵抗提供了新的效果显著的药物。
技术实现思路
本专利技术的需要解决的问题是利用知母提取物抑制UCP2蛋白的表达并将知母提取物开发成改善胰岛素抵抗的药物。1.本专利技术所述知母提取物的制备，知母的主要成分是皂苷、黄酮、双苯吡酮、木质素等。2.知母水提物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，从而达到治疗胰岛素抵抗的实验方法知母水提物给小鼠灌胃2次，间隔8h，用量为90mg/kg；发现在第2次灌胃后6小时后处死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在肾脏中的表达量下降了约30％。3.知母水提取物可以制备成一种改善胰岛素抵抗的药物。本专利技术首次阐明了知母水提取物具有特异性抑制UCP2的效应。目前中医和现代分子生物学的研究还没有很好的结合起来，中药作用的特异性靶位点更是知之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰岛素分泌的负调控因子(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)，在肥胖导致的胰岛功能异常中扮演了重要角色。在此基础上，又进一步发现知母的提取物作用的靶位点就是UCP2，通过特异性抑制UCP2的表达来提高胰岛素分泌，从而达到改善胰岛素抵抗的目的。可制备成一种改善胰岛素抵抗的药物。对胰岛素抵抗的治疗目前临床上多以西药为主，不仅有副作用，用久了还会产生“治疗失效”；中药作为我国的传统治疗药物，从临床和实验研究的角度，均证实其药性温和持久且副作用小(W.L.Li，et al.J Ethnopharmacol，921，2004)，因而知母开发作为改善胰岛素抵抗的药物具有巨大的应用前景，是一种原料价格低廉、生产工艺简单、副作用小的改善胰岛素抵抗的药物。四附图说明图1为给药2次后用普通PCR(RT-PCR)定性检测小鼠肾脏中UCP2信使核糖核酸的表达情况(从左向右1-5为对照组，6-10为给药组)；图2为给药2次后用定量PCR(Real-time PCR)检测分析小鼠肾脏中UCP2信使核糖核酸表达的变化的结果图。五具体实施例方式材料与来源试剂，Trizol购自Invitrogen公司；逆转录酶和Tag酶购于大连宝生物工程有限公司。手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。其它器材Heidolph DIAX900匀浆器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR仪；C57BL/6小鼠购于南京大学模式动物中心实施例1.知母提取物的浓缩方法150g知母加入1L的蒸馏水，加热至沸腾后，煎煮2h，留取上清，残渣重复上述过程一次。两次上清转至旋转蒸发仪60℃蒸发4h后，低温冻干；于4℃保存。2.小鼠给药及组织的分离保存实验用小鼠为SPF级的野生型雄性小鼠，品系C57BL/6，8周龄，饲养于南京市鼓楼医院动物实验中心。用灌胃针按90mg/kg药量灌胃给药2次，时间间隔8h；对照组小鼠用等体积的生理盐水灌胃。第2次灌胃后6h处死小鼠；取小鼠肾脏组织，生理盐水漂洗干净，立即放于冻存管中，于液氮中保存备用。3.组织RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取适量组织加1ml Trizol量于Heidolph DIAX900组织匀浆器将组织充分匀浆(3档90秒)，将匀浆液转入洁净的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，13200rpm离心10分钟，小心吸取上清至另一洁净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，13200rpm离心10分钟，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥，20μl DEPC水溶解，紫外分光法检测浓度和纯度。2μg RNA用于逆转录，反应体系为20μl，含2μg RNA，1mMdNTP，RNA酶抑制剂1 U/μl，Oligo(dT)18引物2.5 pmol/μl，AMV逆转录酶0.5U/μl，轻轻混匀，42℃1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于real-timePCR。real-time PCR为20μl反应体系，分别含0.5μl(检测GAPDH)和1.5μl(检测UCP2)cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，各1pmol/μl上、下游引物及相应的探针，0.025U/μlTag酶，混匀。PCR反应条件95℃5分钟；95℃30秒，60℃1分钟(40个循环)；4℃5分钟。引物和探针序列如下GAPDH上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3下游引物5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3 探针序列5’-CCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’UCP2上游引物5’-CCAATGTTGCCCGWAATG-3’，下游引物5’-TGAGGTTGGCTTTCAGGAG-3探针序列5’-CTGGTGACCTATGACCTCATCAAAG-3’结果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，见附图。从附图可以看出，给药组小鼠肾脏中的UCP2的信使核糖核酸的表达量有显著的降低，说明该知母提取物可以通过抑制小鼠基因UCP2的表达从而达到提高胰岛素分泌进而改善胰岛素抵抗的效果。权利要求1.一种知母提取物，其特征是从中药知母中提取，其主要成分是皂苷、黄酮、双苯吡酮、木质素。2.根据权利要求1所述知母提取物的提取方法，其特征是150g知母加入1L的蒸馏水本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种知母提取物，其特征是从中药知母中提取，其主要成分是：皂苷、黄酮、双苯吡酮、木质素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜晓宏，张辰宇，项阳，孙凌冰，张红杰，孙国勋，邹季虹，徐琛，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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