一种深海虾C型凝集素以及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种深海虾C型凝集素以及应用。深海虾C型凝集素为序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸。所述凝集素可在用于制备细菌凝集制剂中应用。所述凝集素为凝集素经在大肠杆菌中表达获得的重组蛋白。本发明专利技术重组凝集素用于结合并凝集致病细菌。

C type lectin of deep sea shrimp and application thereof

The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a deep sea shrimp C lectin and its application. The deep-sea shrimp amino acid C type lectin is shown in a sequence table SEQ ID No.1. The lectin may be used in the preparation of bacterial agglutinating agents. The lectin is a recombinant protein obtained by lectin in Escherichia coli. The recombinant lectin of the present invention is used to bind and agglutinate pathogenic bacteria.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种深海虾C型凝集素以及应用。
技术介绍
凝集素(Lectin)是一类糖结合蛋白，C型凝集素是其中一大类，为分泌蛋白或跨膜蛋白，其结构中包含约120个氨基酸序列的保守糖结合结构域(carbohydrate-recognitiondomain)，能特异性识别与结合胞外多糖。某些C型凝集素能识别细菌表面的糖分子而与细菌结合，从而被归为一种模式识别受体，其与细菌结合后能激引发一系列的免疫反应发生，如细胞吞噬功能增强、补体激活等，从而帮助机体清除病原菌。因此，C型凝集素在宿主先天免疫反应中发挥着重要作用。目前，深海无脊椎动物的凝集素研究缺乏，其相关凝集素的功能作用亦不清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种深海虾(阿尔文虾)C型凝集素及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种深海虾C型凝集素，深海虾C型凝集素为序列表SEQIDNo.1所示的氨基酸。构建方法，以深海阿尔文虾cDNA为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物经过与载体pBS-T连接转换后与载体pET259连接，获得质粒pEtP208，转化大肠杆菌BL21(DE3)即表达为序列表SEQIDNo.1中氨基酸所示的凝集素。一种深海虾C型凝集素的应用，深海虾C型凝集素在用于制备细菌凝集制剂的应用。所述凝集素为凝集素在大肠杆菌中表达获得的重组蛋白。所述细菌为鳗弧菌或哈氏弧菌。本专利技术具有如下优点：本专利技术的凝集素能够结合并凝集致病细菌鳗弧菌和哈氏弧菌。附图说明图1为本专利技术实施例提供的凝集素重组蛋白对细菌的凝集。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。实施例1本专利技术中的C型凝集素(命名为P208)为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列。序列表SEQIDNo.1为：MTFGKTNFSLFLGGMLMILLALFTLPTGTVADKLQETLIEDDARIIGVDVIDHDNKYQRNKKGGAKFENTVQILNTEPECPPPYFRLMSECFYVHVHHHLPWEVARSFCKDMGGDLAEPSYYGALLAVVSDKYSDGPQHFWLGASDLEEEGHFQWLSGGNVQSGWRTGQPDDDGGIEDCLELWPAKYPSFGDKNCNHSCAFICQYKHQ(a)序列特征：●长度：208●类型：氨基酸序列●链型：单链●拓扑结构：线性(b)分子类型：蛋白质(c)假设：否(d)反义：否(e)最初来源：阿尔文虾结构特点：该蛋白预期含有一个信号肽(氨基酸1-31)和一个C型凝集素结构域(氨基酸91-205)。MTFGKTNFSLFLGGMLMILLALFTLPTGTVADKLQETLIEDDARIIGVDVIDHDNKYQRNKKGGAKFENTVQILNTEPECPPPYFRLMSECFYVHVHHHLPWEVARSFCKDMGGDLAEPSYYGALLAVVSDKYSDGPQHFWLGASDLEEEGHFQWLSGGNVQSGWRTGQPDDDGGIEDCLELWPAKYPSFGDKNCNHSCAFICQYKHQ实施例2凝集素P208的重组蛋白的制备1)表达凝集素P208重组蛋白的质粒pEtP208的构建：pEtP208的构建如下：以深海(1880m)阿尔文虾cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：940C60s预变性模板DNA,然后940C40s,500C60s,720C60s,5个循环后改为940C40s,600C60s,720C60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSP208。将表达载体pET259(pET259构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后回收5.3kb，同时将pBSP208用EcoRV酶切回收0.5kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时,筛选转化子提取质粒，即为pEtP208。DNA测序表明pEtP208含有编码凝集素P208序列的基因。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGCTGTTCACTCTTCCTACGG-3’；R1为5’-GATATCTTGGTGTTTATACTGACAAATAAAG-3’。2)重组凝集素蛋白的诱导表达和纯化将上述的质粒pEtP208用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pEtP208。将BL21/pEtP208于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于370C下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃继续以转速160rpm摇动培养12-14h，而后以5000g，40C离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，40C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化，将纯化的蛋白悬浮于PBS缓冲液，命名为rP08。所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。实施例3重组凝集素的应用步骤1)细菌悬液制备在LB培养基中培养鳗弧菌C312和哈氏弧菌T4至OD600为0.8,然后离心(5000g，40C，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为104cfu/ml，即为鳗弧菌和哈氏弧菌悬液。所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编,100101。保藏编号为：CGMCCNo.6250，保藏日期2012.6.21，分类命名为鳗弧菌(Vibrioanguillarum)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种深海虾C型凝集素，其特征在于：深海虾C型凝集素为序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种深海虾C型凝集素，其特征在于：深海虾C型凝集素为序列表SEQIDNo.1所示的氨基酸。2.按权利要求1所述的深海虾C型凝集素的构建方法，其特征在于：以深海阿尔文虾cDNA为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物经过与载体pBS-T连接转换后与载体pET259连接，获得质粒pEtP208，转化大肠杆菌BL21(DE3)即表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，陈晨，张健，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37