利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，属于细胞结构分析领域。本发明专利技术通过对拟南芥根进行横向冰冻切片后，得到仅含有根冠部位的根部横切，10µm的切片厚度大大降低了显微镜Z轴分辨率对成像真实性的影响；通过优化显微拍摄的条件，减小拍摄步进至小于0.4µm，降低Pinhole值以确保计算的光学切片厚度小于0.8µm，保证了画面的细腻程度，扫描范围包含了一个中柱细胞从上至下的全部结构；可以得到更为细致的显微镜成像图片，有效减少了非焦平面杂散光对图像的影响，提高了图像的分辨率，保证了研究对象结构真实性的呈现；利用这种三维图像重组技术，能够更加直观、准确的确定细胞内部内质网结构。

Method for analyzing the structure of root tip cells of Arabidopsis thaliana by three-dimensional reconstruction imaging

The invention discloses a method for analyzing the structure of the root tip cells of Arabidopsis thaliana by three-dimensional recombination imaging technology, which belongs to the field of cell structure analysis. The root of transverse frozen sections, containing only parts of the root cap are crosscutting, thickness 10 m significantly reduced the Z axial resolution of imaging microscopy effects of authenticity; by optimizing the micro shooting conditions, reduce the step to less than 0.4 m, reduce the value of Pinhole to ensure that the optical the slice thickness calculation is less than 0.8 m, ensure the exquisite degree of the picture, the scanning range includes a column of cells from the top to the bottom of the whole structure; we can get a more detailed picture of microscopic imaging, and effectively reduce the influence of stray light on the focal plane of the image, improve the image resolution, ensure the authenticity of the research object structure present; using 3D image reconstruction technique that can determine the internal structure of the endoplasmic reticulum, the cell more intuitive and accurate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物单细胞光学显微整体成像方法，尤其涉及一种植物单细胞三维整体成像方法，属于细胞结构分析领域。
技术介绍
拟南芥（Arabidopsisthaliana）又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，其基因组大约为12500万碱基对和5对染色体，是目前已知植物基因组中最小的。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”，是一种应用广泛的模式生物，全世界有超过六千家实验室正在对拟南芥的生长发育及其对环境应答的过程开展深入研究。目前对于拟南芥根尖细胞结构的分析，主要有毛细管电泳、微流控芯片、多种光学显微镜（荧光显微镜、聚焦荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、多光子荧光显微镜、荧光相关显微镜、近场扫描光学显微镜等）、扫描电化学显微镜、质谱成像、原子力显微镜、扫描隧道显微镜图像分析、阿达玛变换显微光谱及成像、肿瘤电化学及免疫分析、动力学分析、荧光及发光探针、纳米技术以及实时动态检测等。其中荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。然而，由于拟南芥幼苗的根尖非常细小，一般的根尖细胞显微成像只能直接拿实物在光学显微镜下观察，而且是根的纵向光学切片观察，得到的结果不准确（因为有相邻细胞遮挡的问题）。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，以提高图像的分辨率，保证研究对象结构真实性的呈现。本专利技术利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存。（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块较厚（2~3cm）的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片。（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜LSM510进行拍照。物镜为：Plan-Neofluar×20/0.5、Plan-Neofluar×63/1.4和oilPlan-Neofluar×100/1.4oil。滤光片设置为：检测DAPI时，激发光405nm，发射光420nm-470nm；检测FITC时，激发光488nm，发射光505nm-555nm。光学切片厚度0.3µm，扫描均值为2，图片以1024×1024格式保存。使用CarlZeissAIM软件和OlympusFluoviewVer.1.6软件进行图像的拍摄和分析。（4）ImageJ图像处理在ImageJ中打开连续的纤维切层图像，使用Image→Duplicate…按钮挑选感兴趣的图层，另存为命名后的文件以备后期分析使用；如果感兴趣的是一组图层，则需使用Image→Stacks→ZProject→Projection挑选出相邻的多层图像；区域相对荧光强度的分析：使用多边形框选按钮框选出感兴趣的目标区域，使用Analysis→Measure得到此区域的平均荧光强度；如果要测量同一坐标线上各个点的荧光强度，则使用Analysis→PlotProfile完成；使用Process→FFT→BandpassFilter进行图像的过滤处理，一般将FilterLargeStructureDownto设定为40；使用Process→Filters→GaussianBlur→Sigma设定高斯变换参数，进行数据平滑处理，一般Sigma设为1。（5）三维细胞结构生物影像显微重组在Imaris6.2软件切面视图中打开图像文件，在主工具栏中选择Surpass模式，打开DisplayAdjustment的高级设置，阈值范围在45-200之间；研究对象在视图区域内显示；创建一个文件（Create-Shipautomaticcreation），编辑（Editmanually），改变指针模式为Select，按住Shift键，并点击鼠标在想要的第一个位置上，插入点，移动鼠标至下一个点，按住Shift键，并点击鼠标插入下一个点，如此继续，绘制显微切层上研究区域的轮廓。从上到下，完成所有囊括研究对象的显微切层图像单独多边形的绘制；使用CalculateSurface计算研究对象的轮廓表面，然后点击CreateSurfaces按钮创建表面对象。（可以使用VolumeOverTime）点击MaskProperties中的MaskAll按钮，将其它不感兴趣的表面对象区域掩盖。这样就得到了只有研究对象细胞的三维图像文件。依照上面的方法将所有感兴趣的细胞进行三维图像重组。依次打开所需的文件遮罩层，点击SnapShot调整位置后进行拍照、录像后进行分析。本专利技术相对现有技术具有以下优点：1、本专利技术将观察手段改进为对有拟南芥根进行纵向冰冻切片后，得到仅含有根冠部位的根部横切，10µm的切片厚度大大降低了显微镜Z轴分辨率对成像真实性的影响；在根的横切面上使用光学显微镜进行高密度的扫描后成像，这样可以得到更为细致、全面的根尖细胞结构；2、优化显微拍摄的条件，减小拍摄步进至小于0.4µm，降低Pinhole值以确保计算的光学切片厚度小于0.8µm，保证了画面的细腻程度，扫描范围包含了一个中柱细胞从上至下的全部结构；可以得到更为细致的显微镜成像图片，有效减少了非焦平面杂散光对图像的影响，提高了图像的分辨率，保证了研究对象结构真实性的呈现；3、利用这三维图像重组技术，更加直观、准确的确定细胞内部内质网结构。附图说明图1为拟南芥根的DIC图及内质网和淀粉体分布；图2为HDEL:DR5和KDEL:DR5拟南芥纵向剖面图；图3为拟南芥根尖纵切荧光切层图；图4为HDEL-GFP内质网荧光三维重组图。具体实施方式1.实验材料1.1植物材料拟南芥Columbia0型北京师范大学生命科学学院韩生成教授惠赠拟南芥DR5:HDEL中国科学院植物研究所林金星教授惠赠拟南芥DR5:KDEL中国科学院植物研究所乐捷教授惠赠1.3主要试剂、耗材MS培养基PhytoTechPropidiumiodideSigmaOCT冰冻切片包埋剂LeicaTritonX-100北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司0.22umPVDFfilterMillipore1.4主要仪器设备CM3050S冰冻切片机Leica正置荧光显微镜ImagerA1CarlZeiss共聚焦激光显微镜LSM510CarlZeiss激光共聚焦显微镜-FV300Olympus智能光照培养箱-GZH-268B杭州汇尔仪器设备有限公司真空干燥器MZ250-1北京中镜科仪技术有限公司MultiternI恒温水浴锅LKB&本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存；（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块2~3cm的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片；（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜 LSM 510进行拍照；（4）Image J图像处理在Image J中打开连续的纤维切层图像，使用Image → Duplicate…按钮挑选感兴趣的图层，另存为命名后的文件以备后期分析使用；如果感兴趣的是一组图层，则需使用Image → Stacks → Z Project →Projection挑选出相邻的多层图像；区域相对荧光强度的分析：使用多边形框选按钮框选出感兴趣的目标区域，使用Analysis → Measure 得到此区域的平均荧光强度；如果要测量同一坐标线上各个点的荧光强度，则使用Analysis → Plot Profile 完成；使用Process → FFT → Bandpass Filter 进行图像的过滤处理，一般将Filter Large Structure Down to 设定为40；使用Process → Filters → Gaussian Blur → Sigma设定高斯变换参数，进行数据平滑处理，一般Sigma设为1；（5）三维细胞结构生物影像显微重组在Imaris 6.2软件切面视图中打开图像文件，在主工具栏中选择Surpass模式，打开Display Adjustment的高级设置，阈值范围在45‑200之间；研究对象在视图区域内显示；创建一个文件，编辑，改变指针模式为Select，按住Shift键，并点击鼠标在想要的第一个位置上，插入点，移动鼠标至下一个点，按住Shift键，并点击鼠标插入下一个点，如此继续，绘制显微切层上研究区域的轮廓；从上到下，完成所有囊括研究对象的显微切层图像单独多边形的绘制；使用Calculate Surface计算研究对象的轮廓表面，然后点击Create Surfaces按钮创建表面对象；点击Mask Properties中的Mask All按钮，将其它不感兴趣的表面对象区域掩盖，得到了只有研究对象细胞的三维图像文件；依照上面的方法将所有感兴趣的细胞进行三维图像重组：依次打开所需的文件遮罩层，点击SnapShot调整位置后进行拍照、录像后进行分析。...

【技术特征摘要】
1.利用三维重组成像技术分析拟南芥根尖细胞结构的方法，包括以下工艺步骤：（1）拟南芥根尖的固定：将新鲜拟南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室温孵育30min；而后转移至预冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽气30min；之后放入4℃保存；（2）拟南芥根尖的冰冻切片：在预先速冻好的样品托上涂一块2~3cm的OCT包埋胶，待胶冻住后用刀片修出一个方形台；将之前固定的根尖依次同向摆放在台子上，迅速用另一层包埋胶盖住根尖；待包埋胶冻住后，再用刀片修块，整体铲下包埋有样品的胶块，确定根尖向外；最后将根尖向外的胶块粘在样品托上以0.3µm的步距切片；（3）显微镜成像：先使用正置荧光显微镜ImagerA1在低倍镜下挑选出目的切片，再使用共聚焦激光显微镜LSM510进行拍照；（4）ImageJ图像处理在ImageJ中打开连续的纤维切层图像，使用Image→Duplicate…按钮挑选感兴趣的图层，另存为命名后的文件以备后期分析使用；如果感兴趣的是一组图层，则需使用Image→Stacks→ZProject→Projection挑选出相邻的多层图像；区域相对荧光强度的分析：使用多边形框选按钮框选出感兴趣的目标区域，使用Analysis→Measure得到此区域的平均荧光强度；如果要测量同一坐标线上各个点的荧光强度，则使用Analysis→PlotProfile完成；使用Process→FFT→BandpassFilter进行图像的过滤处理，一般将FilterLargeStructureDownto设定为40；使用Process→Filters→GaussianBlur→Sigma设定高斯变换参数，进行数据平滑处理，一般Sig...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝莹，何大澄，肖雪媛，
申请(专利权)人：西北师范大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62