一种多靶分子浓度检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多靶分子浓度检测方法，包括以下步骤：S1，将多种靶分子各自对应的第一探针分子偶联到磁珠上，形成磁珠探针；将多种靶分子各自对应的第二探针分子分别偶联到多种不同的标记粒子表面，形成多种标记探针；S2，形成靶分子‑磁珠探针复合物；S3，形成磁珠探针‑靶分子‑标记探针复合物；S4，将未参与反应的所述标记探针除去；S5，在经过步骤S4后的反应容器中加入洗脱液，使得所述磁珠探针‑靶分子‑标记探针复合物发生结构解离；S6，通过包含氨基、羧基、巯基、羟基中的一种或者多种的硅烷溶液对载玻片进行表面修饰；S7，计算靶分子的浓度。本发明专利技术的多靶分子浓度检测方法，可实现高通量检测多种靶分子的浓度，且灵敏度也较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测方法，特别是涉及一种同时检测多种靶分子浓度的方法。
技术介绍
高灵敏、高通量的生物检测在疾病的诊断和治疗(尤其是疾病发展的早期)、细菌病毒检测以及临床基础研究中具有重要意义。高灵敏度的特性是指在靶分子浓度非常低的情况下，比较可靠地将其检测到；而高通量的特性是指可一次同时检测多种浓度较低的靶分子，既缩短了检测的时间，又降低了检测的成本，以上两者均是优秀的生物检测方法中不可或缺的特性。目前，很多检测方法更多的追求高灵敏度的特点而无法同时满足高通量的要求。如近年来引起人们极大关注的基于单分子探测的高灵敏探测技术，该技术有望在检测灵敏度上，大大超越传统的基于荧光强度信号的检测模式。然而，普通的单分子探测技术很难同时测定多种靶分子，无法满足高通量的要求，而且该技术往往需要昂贵的仪器支持，如配置有单光子探测能力的共聚焦荧光显微镜、全内反射荧光显微镜等，在成本上往往过于昂贵，很难应用于实际的高灵敏检测中。专利申请CN105132533A中提出的靶分子浓度检测方法，针对单分子检测时具有较高的灵敏度，但同时检测多种靶分子时，无法很好地实现各种靶分子的特异性检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种多靶分子浓度检测方法，可实现高通量检测多种靶分子的浓度，且灵敏度也较高。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种多靶分子浓度检测方法，包括以下步骤：S1，将多种靶分子各自对应的第一探针分子偶联到磁珠上，形成磁珠探针；将多种靶分子各自对应的第二探针分子分别偶联到多种不同的标记粒子表面，形成多种标记探针；所述多种不同的标记粒子被观测时能彼此区分开；S2，在反应容器中，将所述磁珠探针和多种靶分子的溶液混合，所述多种靶分子与相应的第一探针分子反应，所述多种靶分子被捕获至所述磁珠探针的表面形成靶分子-磁珠探针复合物；S3，将所述多种标记探针加入经过步骤S2后的反应容器中，所述多种靶分子与相应的第二探针分子结合，形成磁珠探针-靶分子-标记探针复合物；或者分别将步骤S2，S3替换为如下步骤S2’，S3’，S2’，在反应容器中，将多种标记探针的混合液和多种靶分子的溶液混合，多种靶分子与相应的第二探针分子反应，多种靶分子被分别捕获至多种标记探针的表面；S3’，将所述磁珠探针加入经过步骤S2’后的反应容器中，多种靶分子分别与相应的第一探针分子结合，形成磁珠探针-靶分子-标记探针复合物；S4，将未参与反应的所述标记探针除去；S5，在经过步骤S4后的反应容器中加入洗脱液，使得所述磁珠探针-靶分子-标记探针复合物发生结构解离，解离成所述磁珠探针、所述靶分子和所述多种标记探针；S6，通过包含氨基、羧基、巯基、羟基中的一种或者多种的硅烷溶液对载玻片进行表面修饰，使所述载玻片的表面形成一层自组装膜；S7，吸取经过步骤S5后的溶液在经过步骤S6处理过的载玻片上制成样本，在显微镜下对所述多种标记探针进行计数并计算所述溶液中各种标记探针的数量，通过各标记探针的数量计算相应的靶分子的浓度。本专利技术与现有技术对比的有益效果是：本专利技术的多靶分子浓度检测方法，在对多种靶分子的浓度进行检测时，将不同的标记粒子与相应的靶分子一一对应地结合，后续解离。配合包含特定基团的硅烷溶液对载玻片进行修饰，在载玻片的表面形成一层自组装膜，玻片的表面裸露出上述特定的化学基团，使得载玻片在水溶液中显出一定的电性或者可以与标记探针通过基团结合反应，这样，当包含标记探针的溶液在载玻片上制成样本时，标记探针中探针通过电性吸引或者基团结合反应而固定在载玻片上。这样，各靶分子对应的标记粒子分别固定，彼此的影响较小，很好地保证了靶分子的特异性检测，从而在实现高通量检测的同时确保各单一靶分子的超灵敏检测。本专利技术中使用多种标记粒子可以高通量超灵敏的生物检测，对多种靶分子检测时，检测浓度下限均可以低至3×10-18mol/L。【附图说明】图1是本专利技术具体实施方式的检测方法的检测原理流程图；图2a是本专利技术具体实施方式的检测方法中金纳米球的透射电子显微镜图；图2b是本专利技术具体实施方式的检测方法中金/银复合纳米粒子的透射电子显微镜图；图2c是本专利技术具体实施方式的检测方法中金纳米棒的透射电子显微镜图；图3是本专利技术具体实施方式的检测方法中得到的磁珠探针-靶分子-标记探针的复合物的SEM图；图4a是本专利技术具体实施方式中金纳米棒在暗场显微镜中的图像；图4b是本专利技术具体实施方式中金纳米球在暗场显微镜中的图像；图4c是本专利技术具体实施方式中金/银复合纳米粒子在暗场显微镜中的图像；图4d是本专利技术具体实施方式中金纳米棒、金纳米球及金/银复合纳米粒子同时存在时在暗场显微镜中的图像；图5a是本专利技术具体实施方式中HIV的浓度与实际探测数目的关系图；图5b是本专利技术具体实施方式中HBV的浓度与实际探测数目的关系图；图5c是本专利技术具体实施方式中HPV的浓度与实际探测数目的关系图；图6是本专利技术具体实施方式的检测方法对包含不同靶分子的7个样品进行检测的结果示意图。【具体实施方式】下面结合具体实施方式并对照附图对本专利技术做进一步详细说明。本具体实施方式提供一种检测多种靶分子浓度的方法，以检测三种靶分子为例进行说明，包括如下步骤：(1)将三种靶分子的第一探针分子同时偶联到同一种磁珠表面形成磁珠探针(即将探针Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ同时偶联到同一种磁珠A上)，将第一种靶分子的第二探针分子偶联到第一种标记粒子表面形成第一标记探针，将第二种靶分子的第二探针分子偶联到第二种标记粒子表面形成第二标记探针，将第三种靶分子的第二探针分子偶联到第三种标记粒子表面形成第三标记探针。或者将所述步骤(1)替换为如下步骤(1’)，(1’)将三种靶分子的第一探针分子分别接到三组不同的磁珠上，每组磁珠上对应一种靶分子的第一探针，形成磁珠探针，即将探针Ⅰ偶联到磁珠A上，探针Ⅱ偶联到磁珠B上、探针Ⅲ偶联到磁珠C上。将第一种靶分子的第二探针分子偶联到第一种标记粒子表面形成第一标记探针，将第二种靶分子的第二探针分子偶联到第二种标记粒子表面形成第二标记探针，将第三种靶分子的第二探针分子偶联到第三种标记粒子表面形成第三标记探针。上述靶分子可为DNA分子或者蛋白质分子。标记粒子为在显微镜下可以单个计数的粒子。多种不同的标记粒子为：贵金属纳米粒子、荧光微球、量子点、上转换纳米晶中的不同种的组合。优选地，多种不同的标记粒子均为多种贵金属纳米粒子(如金纳米球、金纳米棒、银纳米球，金/银复合纳米粒子等)，且多种贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振峰位相差50nm以上。贵金属纳米粒子的吸收截面和散射截面比普通的有机荧光分子高出3-5个量级，具有极高的信噪比，彼此之间峰位相差50nm，这样可更好地区分不同的标记探针，进而区分不同的待检测靶分子。(2)在反应容器中，将所述磁珠探针和三种靶分子的溶液混合，所述三种靶分子与相应的所述第一探针分子反应，所述三种靶分子被捕获至所述磁珠探针的表面形成靶分子-磁珠探针复合物。优选地，为减轻其中两种靶分子对另一种靶分子与其相应磁珠探针的结合效率的影响，该步骤设置在快速摇晃或者轻柔超声的环境下进行，摇晃速率为30r/min-60r/min，超声频率为10KHz-30KHz。这样既增加了靶分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多靶分子浓度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，将多种靶分子各自对应的第一探针分子偶联到磁珠上，形成磁珠探针；将多种靶分子各自对应的第二探针分子分别偶联到多种不同的标记粒子表面，形成多种标记探针；所述多种不同的标记粒子被观测时能彼此区分开；S2，在反应容器中，将所述磁珠探针和多种靶分子的溶液混合，所述多种靶分子与相应的第一探针分子反应，所述多种靶分子被捕获至所述磁珠探针的表面形成靶分子‑磁珠探针复合物；S3，将所述多种标记探针加入经过步骤S2后的反应容器中，所述多种靶分子与相应的第二探针分子结合，形成磁珠探针‑靶分子‑标记探针复合物；或者分别将步骤S2，S3替换为如下步骤S2’，S3’，S2’，在反应容器中，将多种标记探针的混合液和多种靶分子的溶液混合，多种靶分子与相应的第二探针分子反应，多种靶分子被分别捕获至多种标记探针的表面；S3’，将所述磁珠探针加入经过步骤S2’后的反应容器中，多种靶分子分别与相应的第一探针分子结合，形成磁珠探针‑靶分子‑标记探针复合物；S4，将未参与反应的所述标记探针除去；S5，在经过步骤S4后的反应容器中加入洗脱液，使得所述磁珠探针‑靶分子‑标记探针复合物发生结构解离，解离成所述磁珠探针、所述靶分子和所述多种标记探针；S6，通过包含氨基、羧基、巯基、羟基中的一种或者多种的硅烷溶液对载玻片进行表面修饰，使所述载玻片的表面形成一层自组装膜；S7，吸取经过步骤S5后的溶液在经过步骤S6处理过的载玻片上制成样本，在显微镜下对所述多种标记探针进行计数并计算所述溶液中各种标记探针的数量，通过各标记探针的数量计算相应的靶分子的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种多靶分子浓度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，将多种靶分子各自对应的第一探针分子偶联到磁珠上，形成磁珠探针；将多种靶分子各自对应的第二探针分子分别偶联到多种不同的标记粒子表面，形成多种标记探针；所述多种不同的标记粒子被观测时能彼此区分开；S2，在反应容器中，将所述磁珠探针和多种靶分子的溶液混合，所述多种靶分子与相应的第一探针分子反应，所述多种靶分子被捕获至所述磁珠探针的表面形成靶分子-磁珠探针复合物；S3，将所述多种标记探针加入经过步骤S2后的反应容器中，所述多种靶分子与相应的第二探针分子结合，形成磁珠探针-靶分子-标记探针复合物；或者分别将步骤S2，S3替换为如下步骤S2’，S3’，S2’，在反应容器中，将多种标记探针的混合液和多种靶分子的溶液混合，多种靶分子与相应的第二探针分子反应，多种靶分子被分别捕获至多种标记探针的表面；S3’，将所述磁珠探针加入经过步骤S2’后的反应容器中，多种靶分子分别与相应的第一探针分子结合，形成磁珠探针-靶分子-标记探针复合物；S4，将未参与反应的所述标记探针除去；S5，在经过步骤S4后的反应容器中加入洗脱液，使得所述磁珠探针-靶分子-标记探针复合物发生结构解离，解离成所述磁珠探针、所述靶分子和所述多种标记探针；S6，通过包含氨基、羧基、巯基、羟基中的一种或者多种的硅烷溶液对载玻片进行表面修饰，使所述载玻片的表面形成一层自组装膜；S7，吸取经过步骤S5后的溶液在经过步骤S6处理过的载玻片上制成样本，在显微镜下对所述多种标记探针进行计数并计算所述溶液中各种标记探针的数量，通过各标记探针的数量计算相应的靶分子的浓度。2.根据权利要求1所述的多靶分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙树清，吴振杰，李国花，何永红，马辉，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44