一种肌肽类似物制备方法，属于医药抗氧化活性物质制备技术领域。本发明专利技术利用酶为催化剂，在催化反应过程中，不进行基团保护、也不使用缩合剂，因此制备工艺简单、反应条件温和、操作简便、充分利用资源、无环境污染、生产成本低、便于工业化生产。采用本发明专利技术制备出的肌肽类似物的纯度高达９３．５～９５．５％、质量好、抗氧化作用强，可广泛用作医药、食品、保健品、化妆品、饲料等的抗氧化活性物质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药抗氧化活性物质制备
，特别涉及肌肽类似物的制备方法。二.
技术介绍
肌肽是由β-丙氨酸的α-羧基与L-组氨酸的α-氨基通过酰氨键组成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pH缓冲等生理功能。肌肽的生物学活性主要是其咪唑环上-N1H-和-N3-的共轭酸及其碱作用所致，因此，含咪唑基的肌肽类似物也具有生物活性。可广泛用于医药、食品、保健品、化妆品、饲料等领域。现有制备肌肽的方法，有化学合成法和从肌肉中直接提取法两类。如专利号ZL03117485X的“一种肌肽的生产方法”公开的化学合成法，是从β-丙氨酸合成出N-苄氧羰基-β-丙氨酸，再由N-苄氧羰基-β-丙氨酸制得一中间体，中间体与组氨酸反应得到保护二肽，N-苄氧羰基-β-丙氨酰组氨酸，经催化氢解得肌肽，其特征是中间体为由N-苄氧羰基-β-丙氨酸与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺反应制成N-苄氧羰基-β-丙氨酸-N′-羟基丁二酰亚胺酯中间体，此中间体再与组氨酸与水、乙酸乙酯、无机碱的混合液进行反应，在pH＝3-4条件下得到保护二肽N-苄氧羰基-β-丙氨酰组氨酸，再在钯/碳催化剂、压力为0.5-2.5MPa条件下氢解后浓缩、结晶得肌肽。该方法使用了β-丙氨酸的氨基保护和组氨酸的羧基保护，及用缩合剂碳化二亚胺进行缩合反应。虽然肌肽生成率高，但是增加了分别保护氨基和羧基及分别脱除氨基和羧基工序，并产生大量含保护基、缩合剂衍生物的有机废水污染环境。又如专利号ZL200510094045的“脑苷肌肽冻干粉及制备方法”公开的是从兔肉中直接提取小分子多肽，由于肌肽含量仅为数毫摩尔/千克肌肉，因此，成本极高且产品纯度低，仅能用于制备调味品，不利于工业批量生产，有碍于推广应用。三.
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有制备肌肽方法的不足之处，提供一种，具有产品纯度高、制备工艺简单、生产成本低、无环境污染、便于推广应用等特点。本专利技术的目的是这样实现的一种，利用酶为催化剂，由于酶是生活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂，其催化反应具有专一性强，反应条件温和等特点。在水溶液中，α-胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸及组氨酸羧基形成的酰胺键。在特定的有机介质中，该酶保持对底物的选择性，催化合成肽。4，5-二羧基咪唑的咪唑杂环类似于芳香环，可定位于α-胰凝乳蛋白酶的活性中心，因此可在该酶催化下合成肌肽类似物4-丙氨酰胺，5-羧基咪唑。在该反应中不必进行基团保护，也不使用缩合剂，而且，只有一种产物4-丙氨酰胺，5-羧基咪唑生成。该反应成本底，因为没有保护和脱保护工序及成本，也不用缩合剂，也无环境污染，是一种值得开发的抗氧化活性物质的新方法。其具体的方法步骤如下(1)制备合成肌肽类似物溶剂在四氢呋喃溶液中，加入pH值为8.5～9.0的浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，磷酸缓冲溶液∶四氢呋喃溶液的的体积比为1∶1000～1250，搅拌均匀后，就制备出含磷酸缓冲液的合成肌肽类似物四氢呋喃溶剂。(2)制备合成肌肽类似物的底物溶液按照4，5二羧酸咪唑∶L-丙氨酸的摩尔比为1∶3～3.5的比例，将4，5二羧基酸咪唑与L-丙氨酸混合并搅拌均匀后，再按照4，5二羧基酸咪唑和L-丙氨酸总重量∶蒸馏水体积为1∶1～1.5的比例，加入蒸馏水并进行搅拌溶解，就制备出合成肌肽类似物的底物溶液。(3)制备合成肌肽类似物反应液在(1)、(2)步完成后，按照α-胰凝乳蛋白酶粉质量∶第(1)步制备合成肌肽类似物溶剂∶第(2)步制备的合成肌肽类似物的底物溶液体积比为1∶32.5～100∶0.04～0.06的比例，先在第(1)步制备合成肌肽类似物的溶剂中，加入第(2)步制备的合成肌肽类似物的底物溶液，搅拌混合均匀后，再置于夹层反应器中，并给反应器缓慢加热或在夹层中通入恒温水，使混合液升温，待反应器中混合液的温度升至40～60℃时，再加入α-胰凝乳蛋白酶粉，在转速为200～400r/min下，搅拌反应1～2h，就制备出4-丙氨酰胺，5-羧酸咪唑产率为63.4～72.5％肌肽类似物的反应液。(4)分离沉淀在第(3)步反应完成后，将肌肽类似物反应液置于离心装置中，以3000～5000r/min的速度，进行离心分离10～20min，使酶粉末沉淀，提取上层清液。然后按照上层清液∶无水乙醇的体积比为1∶1～2的比例，在上层清液中，加入无水乙醇，吸取其中的水分。经搅拌均匀后，静止10～20min，使肌肽类似物反应液中的4-丙氨酰胺-5-羧酸咪唑、L-丙氨酸及4，5-二羧酸咪唑沉淀。然后过滤，分别收集滤渣和四氢呋喃-乙醇滤液。(5)再生乙醇及四氢呋喃将第(4)步收集的四氢呋喃-乙醇滤液，置于真空浓缩器中，在温度为70～90℃、及真空度为-0.8～-0.01MPa的条件下，进行真空浓缩，回收乙醇。然后在回收乙醇后的四氢呋喃溶液中，加入4A分子筛吸收水分，4A分子筛的加入重量为四氢呋喃溶液体积的2～5％，经搅拌处理2～3h后，再进行过滤，分别收集四氢呋喃滤液和4A分子筛滤渣。对收集的四氢呋喃滤液，可再次用于合成肌肽类似物溶剂。对收集的4A分子筛滤渣，进行高温处理挥发水分后，可再次使用。(6)进行树脂交换处理将第(4)步收集的滤渣，用20～30倍的蒸馏水溶解，然后按照滤渣∶阳离子交换树脂的重量比为1∶10～15的比例，在滤渣溶液中，加入阳离子交换树脂(如001×7或001×4等)，进行搅拌交换30～60min，使滤渣溶液中的4-丙氨酰胺、5-羧酸咪唑和L-丙氨酸交换在阳离子树脂上，然后进行过滤，弃滤液，收集树脂滤渣。(7)制备肌肽类似物冻干粉将第(6)步收集的树脂滤渣，用蒸馏水洗涤2～3次后，再过滤，弃滤液，收集树脂滤渣。然后将树脂滤渣置入交换柱中，用0.1～0.2mol/L的HCL洗脱，在洗脱过程中，其洗脱液的流速为每小时3～5倍阳离子树脂重量。并用紫外检测器于310nm检测流出的洗脱液，用分部吸收器，收集310nm出现特征吸收峰的洗脱液，然后将该洗脱液置于截留分子量为100Da的透析袋中，用水透析5～7h。最后置于真空浓缩器中，在温度为80～90℃、真空度为-0.8～-0.01MPa条件下，减压浓缩至原体积的1/10～1/5。再用冻干设备，在温度为-50～-60℃、压力为25～50pa条件下，进行冷冻干燥成肌肽类似物4-丙氨酰胺-5-羧酸咪唑含量为93.5～95.5％的肌肽类似物冻干粉。肌肽类似物冻干粉的检测方法由于肌肽冻干粉中的肌肽类似物4-丙氨酰胺-5-羧酸咪唑含量为93.5～95.5％，水分含量6.5～4.5％，因此肌肽类似物冻干粉在TLC硅胶G60上仅出现一个斑点，其R1值＝0.87；肌肽类似物水溶液分别在240、310、330nm出现特征吸收峰。故将肌肽类似物水溶液进行高效液相色谱分析，在15cm硅胶柱中，进样量为25μl，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长235nm、310nm、330nm的保留时间均为4.25min。本专利技术由于利用酶作为催化剂，催化的反应专一性强，不必进行基团保护，没有副产物生成，反应条件温和，仅需在常温常压下即可进行，也不需要缩合剂，反应产物纯度高，容易分离等特点；本专利技术制备工艺简单、操作简便、生产过程中使用的乙醇、四氢呋喃及离子交换树脂均可再生利用，这样既充分利本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肌肽类似物制备方法，其特征在于其具体的方法步骤如下：（１）制备合成肌肽类似物溶剂在四氢呋喃溶液中，加入ｐＨ值为８．５～９．０的浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲溶液，磷酸缓冲溶液∶四氢呋喃溶液的体积比为１∶１０００～１２５ ０，搅拌均匀；（２）制备合成肌肽类似物的底物溶液按照４，５二羧酸咪唑∶Ｌ－丙氨酸的摩尔比为１∶３～３．５的比例，将４，５二羧基酸咪唑与Ｌ－丙氨酸混合并搅拌均匀后，再按照４，５二羧基酸咪唑和Ｌ－丙氨酸总重量∶蒸馏水体积为１∶１ ～１．５的比例，加入蒸馏水并进行搅拌溶解；（３）制备合成肌肽类似物反应液在（１）、（２）步完成后，按照α－胰凝乳蛋白酶粉质量∶第（１）步制备合成肌肽类似物溶剂∶第（２）步制备的合成肌肽类似物的底物溶液体积比为１∶３２．５～１ ００∶０．０４～０．０６的比例，先在第（１）步制备合成肌肽类似物的溶剂中，加入第（２）步制备的合成肌肽类似物的底物溶液，搅拌混合均匀后，再置于夹层反应器中，并给反应器缓慢加热或在夹层中通入恒温水，待反应器中混合液的温度升至４０～６０℃时，再加入α－胰凝乳蛋白酶粉，在转速为２００～４００ｒ／ｍｉｎ下，搅拌反应１～２ｈ，就制备出４－丙氨酰胺，５－羧酸咪唑产率为６３．４～７２．５％肌肽类似物的反应液；（４）分离沉淀在第（３）步反应完成后，将肌肽类似物反应液置于离心装 置中，以３０００～５０００ｒ／ｍｉｎ的速度，进行离心分离１０～２０ｍｉｎ，提取上层清液，然后按照上层清液∶无水乙醇的体积比为１∶１～２的比例，在上层清液中，加入无水乙醇，经搅拌均匀后，静止１０～２０ｍｉｎ，然后过滤，分别收集滤渣和四氢呋喃－乙醇滤液；再生乙醇及四氢呋喃（５）将第（４）步收集的四氢呋喃－乙醇滤液，置于真空浓缩器中，在温度为７０～９０℃、及真空度为－０．８～－０．０１ＭＰａ的条件下，进行真空浓缩，回收乙醇，然后在回收乙醇后的四氢呋喃溶液中，加入４Ａ 分子筛，４Ａ分子筛的加入重量为四氢呋喃溶液体积的２～５％，经搅拌处理２～３ｈ后，再进行过滤，分别收集四氢呋喃滤液和４Ａ分子筛滤渣，对收集的４Ａ分子筛滤渣，进行高温处理；（６）进行树脂交换处理将第（４）步收集的滤渣，用２０～３ ０倍的蒸馏水溶解，然后按照滤渣∶阳离子交换树脂的重量比为１∶１０～１５的比例，在滤渣溶液中，加入００１×７或００１×４阳离子交...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周小华，陆瑶，左瑞雅，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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