一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基技术

本发明专利技术公开了一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法，属于植物细胞工程技术领域。该培养方法包括如下步骤：（1）取花蕾，4℃预处理1~7天；（2）花蕾消毒；（3）剥取花药；（4）接种；（5）愈伤组织和胚状体诱导；（6）分化调控；（7）生根培养；（8）驯化与移栽；（9）加倍处理。本发明专利技术中基本培养基为改良的MSB培养基，由MS无机盐和B5有机物构成，有利于胚状体和再生植株根的分化，本发明专利技术为辣椒花药培养获得单倍体提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有较好的社会效益和经济效益。

Method for preparing dry pepper haploid plant by anther culture and culture medium thereof

The invention discloses a method for preparing dried pepper haploid plants through anther culture, which belongs to the technical field of plant cell engineering. The training method comprises the following steps: (1) the bud, 4 C pretreatment 1~7 days; (2) bud disinfection; (3) stripping of anther; (4) vaccination; (5) callus and embryoid induction; differentiation; (6) (7) (8) rooting culture; domestication and transplanting; (9) double handle. In the invention, the basic medium for the improvement of MSB, MS is composed of inorganic salts and organic compounds B5, is favorable to the differentiation of embryoid and regenerated plant roots, the invention provides a method for obtaining haploid convenient, fast and effective for anther culture of pepper, has good social and economic benefits.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物细胞工程
，具体涉及一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基。
技术介绍
我国是辣椒种植大国，辣椒资源相当丰富，总产量已居世界之首，其中制干辣椒种植面积近600万亩，年产干辣椒60多万吨，产值近60亿元，已成为农民致富的重要经济作物之一。新疆具有独特的种植制干辣椒的气候条件，是世界适宜种植辣椒的少数地区之一，常年种植面积和产量均占全国的65%以上，加工辣椒产业已成为新疆“红色产业”的重要组成部分。但适合新疆种植的加工辣椒品种不多，迫切需要通过生物技术手段促进品种选育。花药培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段，在育种工作中，利用这项技术除了可以缩短材料的纯化时间，对杂交F1、F2的花药培养可选择出特异的性状外，还可以通过花药培养方法建立DH群体，直接获得纯化的品系，进而作为育种中间材料或亲本育成新品种。生物技术和常规育种相结合，已成为当代作物育种的一大特点。应用单倍体培养所得的双单倍体植株，无论是在作物的育种，还是在遗传图谱构建、重要性状的QTL定位及基因的克隆筛选等分子生物学研究都有着重要的应用价值。目前辣椒花药培养或小孢子培养仍然存在着基因型限制、培养过程繁琐、成胚率低、畸形苗率高等需要克服的问题，限制了单倍体育种技术在育种实践中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基配方。本专利技术的目的可以通过以下实施方案获得：首先供试辣椒于春季（4月）植于大田中，待现蕾后，选取无病虫害植株的花蕾。取材时间一般在晴天、无（少）露水时进行，在温度较低、日照较弱的8:00~10:00进行，选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，将取好的花蕾立即放于冰盒中，回实验室后放置4℃冰箱预处理1~7天。预处理后的花蕾放在0.1%升汞溶液中表面消毒10min，无菌水冲洗3-4次，倒在无菌滤纸上，用两把尖头小镊子一把夹住花蕾底部一把镊子将花瓣部分拔出，然后将花瓣剥离开取出花药接种在已灭菌的诱导培养基上，每皿放30个左右的花药，然后用Parafilm膜封口。诱导培养基以改良的MSB培养基为基本培养基，设置两种激素组合处理（0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LKT和0.5mg/LNAA+0.1mg/LKT）。采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间为15~20min。28℃恒温培养箱中，黑暗条件下诱导培养4周后继代于分化培养基上（生长素减半的诱导培养基），继续黑暗培养可见明显子叶的成熟胚状体和胚性愈伤组织（图1-3）。剥离成熟胚状体，28℃光照条件（2000lux）下进行生根培养（图4），长出发达根系后进行水培炼苗（图5），驯化后移栽至营养土和蛭石（3:1）混拌的土钵中（图6）；植株长势稳健后用脱脂棉蘸取0.25%秋水仙素进行加倍处理48小时（图7）。本专利技术所提供的进行辣椒花药培养的基本培养基为改良的MSB培养基，由MS的无机盐成分和B5培养基的有机成分组成，诱导培养基具体组成如下：硝酸钾1.9g/L、硫酸铵1.65g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、七水硫酸镁0.37g/L、二水氯化钙0.44g/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸1mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、肌醇100mg/L，蔗糖30g/L、琼脂9g/L，pH为5.8~6.0。所述辣椒为杂交F1的二倍体辣椒，包括牛角椒、羊角椒、线椒等制干辣椒品种。本专利技术具有以下有益效果：1、从一批来自全国适应新疆种植，生物学形状优秀的辣椒杂交F1代或杂交组合进行花药培养实验，建立起一套简便高效的再生体系，达到愈伤组织诱导率达20%以上，出胚率达到5%以上，正常苗率60%以上，10周内获得完整再生植株。2、本专利技术的培养方法简便，仅需要在固体培养基上继代培养一次后就可以获得再生植株。3、本专利技术的培养基是改良的MSB培养基，通过改善了有机物成分促进再生植株根的发育，有利于获得更多的正常再生植株。附图说明图1继代一次后的胚状体发生图2单个花药分化的成簇胚状体图3花药分化的胚性愈伤组织图4正常的再生植株图5水培炼苗图6再生苗的移栽图7染色体加倍具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。无机盐购自国药集团化学试剂有限公司和北京化学试剂公司；2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、激动素（KT）和维生素购自SIGMA公司；肌醇购自国药集团化学试剂有限公司；蔗糖购自北京北化精细化学品有限责任公司，琼脂粉购自北京振泰科技创新发展中心。实验步骤如下：选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，放置4℃冰箱预处理1—7天不等。将处理好的材料在超净工作台无菌条件下，把花蕾放在0.1%升汞溶液中表面消毒10min，用无菌水冲洗3次。消毒后倒在无菌滤纸上，用两把尖头镊子，一把枪形镊子夹住花蕾底部一把眼科镊子将花瓣部分拔出，然后将花瓣剥离开取出花药接种，每皿放30个左右的花药，Parafilm膜封口。诱导培养基为改良的MSB培养基附加植物激素组成，MSB基本培养基组成为：硝酸钾1.9g/L、硫酸铵1.65g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、七水硫酸镁0.37g/L、二水氯化钙0.44g/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸1mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、肌醇100mg/L。此外，附加两个植物激素组合分别为2，4-二氯苯氧乙酸0.1mg/L和激动素0.1mg/L，以及萘乙酸0.5mg/L和激动素0.1mg/L。附加3%(W/V)蔗糖，0.9%(W/V)琼脂。采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15~20min。将接种了花药的培养皿放入28℃的恒温培养箱中黑暗培养，4周后可见少量胚状体和愈伤组织；随后继代于分化培养基上，继续黑暗培养直至可见明显子叶的成熟胚状体。剥离成熟胚状体接种于生根培养基上进行生根培养；待幼苗长出发达根系后进行水培炼苗，随后移栽至土钵中；植株长势稳健后进行加倍处理，脱脂棉蘸取0.25%秋水仙素于生长点和腋芽处，处理48小时，期间添加秋水仙素保湿。可考虑加倍2-3次，以保证加倍效果。2011年，对6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）取样，选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾， 4℃冰箱预处理1~7天；（2）消毒；（3）剥取花药；（4）接种，每皿放30个花药，Parafilm 膜封口；（5）诱导培养，28 ℃的恒温培养箱中黑暗培养；（6）分化调控，诱导培养4周后继代于分化培养基上，继续黑暗培养直至获得可见明显子叶的成熟胚状体；（7）生根培养，剥离成熟胚状体接种于生根培养基上进行生根培养；（8）驯化移栽，待幼苗长出发达根系后进行驯化，随后移栽至土钵中；（9）加倍处理，植株长势稳健后进行加倍处理。

【技术特征摘要】
1.一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）取样，选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，4℃冰箱预处理1~7天；（2）消毒；（3）剥取花药；（4）接种，每皿放30个花药，Parafilm膜封口；（5）诱导培养，28℃的恒温培养箱中黑暗培养；（6）分化调控，诱导培养4周后继代于分化培养基上，继续黑暗培养直至获得可见明显子叶的成熟胚状体；（7）生根培养，剥离成熟胚状体接种于生根培养基上进行生根培养；（8）驯化移栽，待幼苗长出发达根系后进行驯化，随后移栽至土钵中；（9）加倍处理，植株长势稳健后进行加倍处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于剥取花药过程为将消过毒的花蕾倒在无菌滤纸上，用两把尖头小镊子一把夹住花蕾底部，一把镊子将花药部分拔出，剥开花瓣取出花药。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于接种中使用的诱导培养基为MSB培养基附加了0.1mg/L2,4-D和0.1mg/LKT或0.5mg/LNAA+0.1mg/LKT。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于分化调控过程中使用的分化培养基为MSB附加0.05mg/L2,4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱华国，赖黎丽，孙杰，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65