一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法技术

本发明专利技术公开了一种新生仔猪睾丸生殖干细胞(mGSCs)的高效获取方法，其包括以下步骤：通过两步酶法消化获取新生仔猪的睾丸组织单细胞悬液；利用差速贴壁法去除睾丸组织中成纤维类的贴壁细胞；差速贴壁5次以后，收集未贴壁细胞，所述未贴壁细胞中含有淋巴细胞、红细胞和mGSCs；利用密度梯度离心方法将淋巴细胞和红细胞与mGSCs分离，即得到高纯度的mGSCs。本发明专利技术的方法操作简单，重复性好，成功率高，高效的获取高比例的mGSCs，对于后期研究mGSCs性质及其应用具有重要作用。不仅可应用于猪mGSCs生物学性质研究的科研平台、也可以在猪mGSCs介导的动物育种、品种改良和濒危品种保存等方面具有潜在的应用前景。

An efficient method for obtaining reproductive stem cells from newborn piglets

The invention discloses a newborn piglet germ stem cells (mGSCs), the acquisition method, which comprises the following steps: acquiring newborn piglet testis cell suspension through two step enzymatic digestion; the fiber class of adherent cells in differential adherent removal of testicular tissue after differential adhesion; the wall 5 times, collecting non adherent cells, the adherent cells containing cells, red blood cells and mGSCs; using density gradient centrifugation method and separation of red blood cells and mGSCs lymphocytes, to obtain high purity mGSCs. The method of the invention has the advantages of simple operation, good repeatability, high success rate and high ratio of mGSCs, which is very important for the research and application of mGSCs in the later period. It can not only be applied to the scientific research platform for the biological properties of pig mGSCs, but also can be used in pig mGSCs mediated animal breeding, variety improvement and conservation of endangered species.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于成体干细胞研究
，更具体地，本专利技术涉及一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法。
技术介绍
雄性生殖干细胞(malegermlinestemcells,mGSCs)是一类存在雄性动物睾丸中具有维持自我更新保持自身恒定和源源不断分化精子繁衍后代的干细胞。新生动物睾丸组织内存在多种类型的细胞(生殖细胞、间质细胞、支持细胞、类肌细胞、血管和淋巴管上皮细胞、血细胞和淋巴细胞)，新生动物睾丸组织内多种细胞都呈现未分化的状态，相对集中的呈现出各种具有干性的细胞，如mGSCs和间质干细胞(stemleydigcells,SLCs)，这时还并未出现分化的生殖细胞和间质细胞，这个时期对于富集mGSCs优于其他时期。未成熟的支持细胞、类肌细胞、间质细胞和血管和淋巴管上皮细胞等成纤维样生长的细胞，表现出增殖和贴壁能力强，利用体外差速贴壁法可以去除，Percoll密度梯度离心的方法是有效的将淋巴细胞、血细胞和成体细胞分开的方法，这些分离措施虽然早已应用到mGSCs分离中，但以往利用这些方法获取mGSCs的纯度并不高。对于传统分离方法，通过免疫学建立起来的免疫磁珠和流式分离方法，更多的应用到成体干细胞分离中，但是一个目前主要的瓶颈是成体干细胞并未发现一种特异的分子标记，特别是特异的膜表面标记，很多早先报道特异膜表面标记先后被证实并不呈现一种特异的状态，早先证实GFRA1，THY-1和PGP9.5等一系列膜表面标记特异表达在mGSCs上，但结果在使用这些膜表面分子标记分选人和家畜的mGSCs，却发现结果中的细胞存在大量的间质细胞；证明了这些标记可能也表达在间质细胞上。目前，利用免疫学分离方法还并不能有效的实现大动物和人的生殖干细胞的纯化。虽然mGSCs研究已开展多年，但是人和家畜mGSCs体外体系仍然未建立成功，目前仅存在啮齿动物的mGSCs系，这和细胞纯度和生物性质等有直接关系。其中细胞纯度对于培养和后期细胞生物学研究至关重要。成体干细胞数量少，分布广，分离难，是制约研究和应用的主要问题。而人和家畜的mGSCs体系未建立成功，这和不完善的分离方法存在直接关系。细胞系是研究细胞生物学性质和药物筛选的重要材料，获得高纯度单一种类细胞是建立细胞系的首要基础。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法，该方法简化了操作步骤，优化了纯化效率，提高了重复性，提高了分离细胞的纯度。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：(1)、通过胰蛋白酶和胶原蛋白的两步酶消化法获得新生仔猪的睾丸组织单细胞悬液；(2)、利用差速贴壁法将睾丸组织中贴壁能力强的成纤维类的细胞贴壁而被去除；(3)、差速贴壁5次以后，基本都是不贴壁的细胞时，收集这些未贴壁细胞，所述未贴壁细胞中含有淋巴细胞、红细胞和生殖干细胞；(4)、利用Percoll密度梯度离心方法将密度不同的淋巴细胞和红细胞与生殖干细胞分离，即得纯的生殖干细胞。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述胰蛋白酶的浓度为0.25wt％，所述胶原蛋白酶的浓度1mg/mL。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述差速贴壁法中所用的多聚赖氨酸的浓度为0.1mg/ml，可以高效短时间的去除贴壁能力强的睾丸成纤维细胞。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述差速贴壁的次数为5次，基本上去除掉了成纤维类的贴壁细胞。在其中一些实施例中，步骤(4)中所述密度梯度离心方法为：配置20％和40％两个梯度的Percoll离心液，底层加入40％Percoll液，上层加入20％的Percoll液，离心后，mGSCs处于40％Percoll液顶部，也就是20％的Percoll液底部，而红细胞离心后处于离心管底部，淋巴和细胞碎片在20％Percoll液面顶部，达到分离的目的。在其中一些实施例中，步骤(1)中所述睾丸组织为去掉了脂肪垫白膜和结缔组织的睾丸组织。在其中一些实施例中，所述新生仔猪为1～5天的新生仔猪。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术结合传统的差速贴壁法和密度梯度离心方法，摸索了不同时间点、处理方法和浓度，通过大量试验和优化，将含有多种类型细胞的新生仔猪睾丸组织中的mGSCs分离出来，在原有的分离方法基础上，优化建立起一套有效的新生仔猪mGSCs的分离纯化方法，操作简单，重复性好，成功率高，对比以往的分离方法具有明显优势，这种方法获取的mGSCs展现出形态均一，折光性好，流式检测结果显示纯度达到85％以上，达到了细胞培养的要求，高效的获取高比例的mGSCs，对于后期研究mGSCs性质及其应用具有重要作用。2、本专利技术的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法不仅可应用于猪雄性生殖干细胞生物学性质研究的科研平台、也可以在猪雄性生殖干细胞介导的动物育种、品种改良和濒危品种保存等方面具有潜在的应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例1的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法的路线图；图2是本专利技术实施例1的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法的模式图；图3是本专利技术实施例1中差速贴壁法获取高纯度mGSCs过程中的细胞状态图，其中，A：单细胞悬液；B：贴壁的成纤维样细胞；C：未贴壁的细胞；D：淋巴细胞和细胞碎片；E：红细胞；F：纯化的生殖干细胞；G：碱性磷酸酶染色；图4为本专利技术实施例2中流式细胞术分析新分离mGSCs的纯度的分析结果；图5为本专利技术实施例3中对生殖干细胞的组织化学染色与免疫荧光检测结果图；其中，A：纯化后猪mGSCs免疫荧光染色；B：原位组织化学染色；图6为本专利技术实施例4中对生殖干细胞的生殖标记检测和分析结果，其中，A：RT-PCR检测；B：蛋白检测。具体实施方式下面结合附图和具体实施例来对本专利技术作进一步说明。以下实施例中，OCT4(鼠源)、PGP9.5(兔源)和C-KIT(大鼠源)单克隆抗体购于Millipore公司；CD29(鼠源)购于BD公司；GFRA1(鼠源)、PLZF(鼠源)、LIN28(兔源)和CD90(鼠源)单克隆抗体购于SantaCruz公司；NANOG(兔源)单克隆抗体购于(cellsignalingtechnology,CST)公司；(AlexaFluor568)荧光标记羊抗鼠二抗，(AlexaFluor568)荧光标记羊抗兔二抗，(FITC)荧光标记羊抗鼠二抗购于Invitrogen公司；Hoechst33342购于MolecularProbes公司。其他原料均来源于市售。实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、通过胰蛋白酶和胶原蛋白酶的两步酶消化法获得新生仔猪的睾丸组织单细胞悬液；(2)、利用差速贴壁法使睾丸组织中贴壁能力强的成纤维类的细胞贴壁而被去除；(3)、差速贴壁5次以上，收集未贴壁细胞，所述未贴壁细胞中含有淋巴细胞、红细胞和生殖干细胞；(4)、利用Percoll密度梯度离心方法将密度不同的淋巴细胞和红细胞与生殖干细胞分离，即得纯的生殖干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、通过胰蛋白酶和胶原蛋白酶的两步酶消化法获得新生仔猪的睾丸组织单细胞悬
液；
(2)、利用差速贴壁法使睾丸组织中贴壁能力强的成纤维类的细胞贴壁而被去除；
(3)、差速贴壁5次以上，收集未贴壁细胞，所述未贴壁细胞中含有淋巴细胞、红细胞和
生殖干细胞；
(4)、利用Percoll密度梯度离心方法将密度不同的淋巴细胞和红细胞与生殖干细胞分
离，即得纯的生殖干细胞。
2.根据权利要求1所述的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法，其特征在于，步骤
(1)中所述胰蛋白酶的浓度为0.25wt％，所述胶原蛋白酶的浓度1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法，其特征在于，步骤
(2)中所述差速贴壁法中所用的多聚赖氨酸的浓度为0.1mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：白银山，张守全，朱翠，冯美莹，卫恒习，李莉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44