一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。本发明专利技术所提供的方法可用于去除所有叶片蛋白质中RuBisco蛋白，包括如下步骤：(1)制备匀浆；(2)匀浆离心；(3)第一上清液离心；(4)第二上清液离心；(5)蛋白粗沉淀的洗涤。用本发明专利技术的方法提取植物叶片蛋白，有利于减少高丰度蛋白RuBisco干扰、提高2-DE电泳分辨率，为优化植物叶片蛋白质组检测，运用生物技术手段进一步改良品种打下基础。

A method for removing RuBisco protein in leaves of Broussonetia papyrifera

The invention discloses a method for removing RuBisco protein in leaves of Broussonetia papyrifera. The method provided by the invention can be used to remove all RuBisco protein in leaves, which comprises the following steps: (1) preparation of homogenate; (2) homogenate and centrifuge; (3) the first centrifugal supernatant; (4) second supernatant centrifugation; (5) the crude protein precipitation washing. The extraction of plant leaf protein by the method of the invention can reduce the high abundance protein RuBisco interference and improve 2-DE electrophoresis, for the optimization of plant leaf protein detection, using biological technology to lay the foundation for further improvement of varieties.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质分离检测领域，涉及一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。
技术介绍
构树是一种多功能综合性树种，整个植株都具有开发潜力。其叶片含有丰富的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等营养成分，可以部分替代豆粕、麦麸等常规饲料，用于猪、牛、羊等家畜养殖。在我国饲料行业的配方技术结构仍以玉米-豆粕型为主。豆粕、玉米等大宗原料对外依存度越来越高，受国际市场影响愈来愈大。因此，如何突破现有的配方技术，开发新的原料和替代品，成为增强企业综合实力，提高竞争力的重要挑战。构树叶片正是解决这一问题的关键。2015年构树扶贫以列为国务院十大精准扶贫项目之一。双向凝胶电泳技术作为研究植物蛋白质组的重要手段，为生物技术手段进行品种改良提供重要理论依据。在双向凝胶电泳技术(2-DE)中，RuBisco这种超高丰度的蛋白会严重限制低丰度蛋白的检测。主要有三方面的影响：一方面蛋白上样量有限，低丰度蛋白因为含量太少在后续的染色过程中不能显现；另一方面是RuBisco的位置效应，RuBisco蛋白会掩盖周围的低丰度蛋白；第三是在双向上整体干扰其它蛋白的正常电泳分离，其周围蛋白点的泳道变化最为明显。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。本专利技术所提供的去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，是利用浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。进一步，所述去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，可包括如下步骤：(1)将植物叶片放入GMⅠ匀浆液中研磨后得到第一匀浆，将GMⅡ匀浆液加入到所述第一匀浆中研磨后得到第二匀浆；所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及浓度为：15-25mMMgCl2和0.8-1.2mMPMSF；所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及浓度为：15-25mMMgCl2、0.8-1.2mMPMSF和3-5％(体积百分含量)NonidetP-40；其中，pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液为本领域常规表示方法，指400-600mMTris溶液用HCl调pH至7-9的缓冲液。(2)将所述第二匀浆于4℃8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第一上清液；(3)向所述第一上清液中加入等体积的浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶剂为去离子水)，冰上静置20min-40min，于4℃8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第二上清液；(4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4体积的浓度为400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶剂为去离子水)，冰上静置30min-50min，于4℃8000-12000g离心5min-15min，弃上清，得蛋白粗沉淀；(5)向所述蛋白粗沉淀中加入4℃预冷的溶液A，于4℃8000-12000g离心5min-15min，弃上清，得沉淀，完成一次洗涤；重复所述洗涤的步骤至少一次，最后一次所得沉淀即为去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白；所述溶液A的溶剂为丙酮，溶质及浓度为10g/L二硫苏糖醇(DTT)。在所述方法的步骤(1)中，所述植物叶片、所述GMⅠ匀浆液与所述GMⅡ匀浆液的使用配比可为0.5g：500-700μL：500-700μL。步骤(1)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比可为0.5g：1000-2000μL。步骤(1)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比可为0.5g：400-600μL。步骤(5)中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比可为1：(3-5)。进一步，在所述方法的步骤(1)中，所述植物叶片、所述GMⅠ匀浆液与所述GMⅡ匀浆液的使用配比具体为0.5g：600μL：600μL。步骤(1)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比具体为0.5g：1500μL。步骤(1)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比具体为0.5g：500μL。步骤(5)中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比具体为1：4。在本专利技术中，所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液，溶质及浓度具体为：20mMMgCl2和1mMPMSF。所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液，溶质及浓度具体为：20mMMgCl2、1mMPMSF和4％(体积百分含量)NonidetP-40。在所述方法的步骤(2)-步骤(5)中，所述离心均具体为4℃10000g离心10min。在所述方法的步骤(3)中，所述冰上静置的时间具体为30min。步骤(4)中，所述冰上静置的时间具体为40min。在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，共进行所述洗涤2次。本专利技术的第二个目的是提供一种用于去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的成套产品。本专利技术所提供的用于去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的成套产品，含有如下：(a1)GMⅠ匀浆液；所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制)，溶质及浓度为：15-25mMMgCl2和0.8-1.2mMPMSF；在本专利技术中，所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制)，溶质及浓度具体为：20mMMgCl2和1mMPMSF。(a2)GMⅡ匀浆液；所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制)，溶质及浓度为：15-25mMMgCl2、0.8-1.2mMPMSF和3-5％(体积百分含量)NonidetP-40；在本专利技术中，所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制)，溶质及浓度具体为：20mMMgCl2、1mMPMSF和4％(体积百分含量)NonidetP-40。(a3)浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶剂可为水)；(a4)浓度为400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶剂可为水)；(a5)溶液A；所述溶液A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，是利用浓度为300‑500g/L的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，是利用浓度为300-500g/L
的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将植物叶片放入GMⅠ匀浆液中研磨后得到第一匀浆，将GMⅡ匀浆液加入
到所述第一匀浆中研磨后得到第二匀浆；
所述GMⅠ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及
浓度为：15-25mMMgCl2和0.8-1.2mMPMSF；
所述GMⅡ匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mMTris-HCl缓冲液，溶质及
浓度为：15-25mMMgCl2、0.8-1.2mMPMSF和体积百分含量为3-5％的NonidetP-40；
(2)将所述第二匀浆于4℃8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第一
上清液；
(3)向所述第一上清液中加入等体积的浓度为300-500g/L的PEG4000溶液，冰
上静置20min-40min，于4℃8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第二上清
液；
(4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4体积的浓度为400-600g/L的
三氯乙酸溶液，冰上静置30min-50min，于4℃8000-12000g离心5min-15min，弃上
清，得蛋白粗沉淀；
(5)向所述蛋白粗沉淀中加入4℃预冷的溶液A，于4℃8000-12000g离心
5min-15min，弃上清，得沉淀，完成一次洗涤；重复所述洗涤的步骤至少一次，最后
一次所得沉淀即为去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白；
所述溶液A的溶剂为丙酮，溶质及浓度为10g/L的二硫苏糖醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述植物叶片、所
述GMⅠ匀浆液与所述GMⅡ匀浆液的使用配比为0.5g：500-700μL：500-700μL；或
步骤(1)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比为0.5g：
1000-2000μL；或
步骤(1)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸溶液的使用配比为0.5g：
400-600μL；或
步骤(5)中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比为1：
(3-5)。
4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈世华，王小曼，邳植，藤林宏，彭献军，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11