一种以对苯乙烯磺酸钠为单体的胰蛋白酶印迹微球的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种以对苯乙烯磺酸钠为功能单体进行制备胰蛋白酶分子表面印迹微球的方法，以戊二醛为交联剂制得了交联聚乙烯醇微球，并通过甲基丙烯酰氯与微球表面羟基之间的酯化反应使交联聚乙烯醇微球表面含有大量可聚合的双键，缓冲溶液中，对苯乙烯磺酸钠与模板胰蛋白酶自动形成主-客体复合物，利用过硫酸铵/亚硫酸氢钠引发体系所产生的自由基使包围在胰蛋白酶周围的单体对苯乙烯磺酸钠与交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺在微球表面发生接枝交联聚合反应，制得了胰蛋白酶表面印迹微球，该分子表面印迹微球对胰蛋白酶具有优良的结合亲和性和特异的识别选择性，对于应用分子表面印迹技术提取胰蛋白酶具有积极的参考价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能高分子与蛋白质工程
，具体为一种以对苯乙烯磺酸钠为功能单体制备具有识别选择性的胰蛋白酶分子表面印迹微球的制备方法。
技术介绍
胰蛋白酶不仅是一种重要的消化酶，而且是一种特异性肽链内切酶，广泛应用于临床医药学、食品加工业、皮革制造及生丝处理等生物
但是从动物组织中提取出的胰酶粗酶液是多种酶的混合物，目前分离纯化胰蛋白酶的方法主要有多种色谱法、多种沉淀法及离子交换法，这些方法存在有或分离规模小、或分离效果较差及操作步骤较繁杂等缺点，需要发展更为有效的胰酶纯化材料与技术。分子印迹聚合物(MIPs)是迄今为止选择识别性最高的分离介质，目前以分子印迹聚合物(MIPs)为固体吸附剂的分子印迹固相萃取（MIPSE）技术，广泛应用于各种物质的高效分离与纯化领域[PuociF,ScomaA,CirilloG,etal.ChemicalEngineeringJournal,2012,198–199:529–535.]，在生物大分子的分离与纯化方面MIPSE也得到了广泛应用[SoleimaniM,GhaderiS,AfsharMG,etal.MicrochemicalJournal,2012,100:1–7.]。但是，传统的分子印迹技术为包埋法，该方法印迹效率比较差（主要是印迹位点较少，对模板分子识别性能差，印迹颗粒孔道深，模板分子接近识别位点的扩散阻力大）。为了发展分子印迹技术，科技工作者大力发展了分子表面印迹技术，设法将分子印迹空穴置于固体微粒（微球）表面，大大提高了分子印迹效率，极大地促进了分子印迹技术的发展。对苯乙烯磺酸钠属于一种阴离子单体，能够与胰蛋白酶分子之间也产生强烈的静电相互作用。以对苯乙烯磺酸钠作为功能单体，采用接枝聚合与表面印迹同步进行的方法，制备胰蛋白酶分子表面印迹材料，实现胰蛋白酶的分离与纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于以对苯乙烯磺酸钠为功能单体制备一种胰蛋白酶分子表面印迹材料；以交联聚乙烯醇CPVA微球为基质，使甲基丙烯酰氯与交联聚乙烯醇CPVA微球表面的羟基发生快速的酯化反应，制得表面含有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；在水溶液中，以静电相互作用为作用力，阴离子单体对苯乙烯磺酸钠与模板分子胰蛋白酶结合形成复合体；过硫酸铵/亚硫酸氢钠引发体系所产生自由基，使包围在胰蛋白酶周围的单体对苯乙烯磺酸钠与交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺在微球MAO-CPVA表面发生接枝交联聚合，从而制得胰蛋白酶表面印迹微球MIP-PSSS/CPVA。本专利技术采用如下的技术方案实现：一种以对苯乙烯磺酸钠为单体的胰蛋白酶印迹微球的制备方法。具体步骤如下：步骤一，在反相悬浮体系中，加入体积百分比为2~5%的聚乙烯醇溶液，和体积百分比为0.2~0.6%的戊二醛溶液，在55~65℃条件下反应6~8h，制得交联聚乙烯醇CPVA微球；步骤二，将含有质量百分比为4~9%的交联聚乙烯醇微球CPVA浸泡于丙酮溶液中充分溶胀，加入体积百分比为5~10%的甲基丙酰氯及少量碳酸钠，在30~45℃下反应6~12h，制得表面键合有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；步骤三，在磷酸盐缓冲溶液中加入质量百分比为13~18%的对苯乙烯磺酸钠，然后再按照单体对苯乙烯磺酸钠与模板胰蛋白酶的摩尔比500:1~700:1的比例加入胰蛋白酶，搅拌使其相互作用一定时间形成主-客体复合物溶液；步骤四，将步骤三的主-客体复合物溶液加入到装有搅拌器、冷凝管和温度计的四口烧瓶中，加入质量百分比为2~7%的改性微球MAO-CPVA，溶胀一定时间后，加入质量百分比为0.15~0.45%的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气30min，升温至25~40℃后加入质量百分比为0.05%~0.1%的过硫酸铵和质量百分比为0.1~0.2%的亚硫酸氢钠，反应10~14h，实现胰蛋白酶分子的表面印迹；步骤五，采用摩尔浓度为2~3mol/L的氯化钠溶液将步骤四所得的印迹微球进行充分的洗脱，直至洗脱液中检测不到胰蛋白酶为止，然后用蒸馏水冲洗干净，真空干燥，得到表面含有大量模板孔穴的胰蛋白酶表面印迹微球MIP-PSSS/CPVA。本专利技术的优点在于：（1）采用分子表面印迹的方法克服了传统分子印迹采用包埋法时印迹位点较少，对模板分子识别性能差，印迹颗粒孔道深，模板分子接近识别位点的扩散阻力大等缺点。（2）以交联聚乙烯醇微球为基质，使印迹微球具有良好的生物相容性，且制备的印迹微球具有重复使用性能好、稳定性高、制作工艺简单、操作方便等优点。具体实施方式实施例1在装有液体石蜡和span-60的四口烧瓶中，加入16mL聚乙烯醇与2mL的戊二醛，在60℃下反应7h，制得交联聚乙烯醇微球CPVA。将2g交联聚乙烯醇微球置于35mL丙酮溶液中，浸泡12h，使微球溶胀后加入2mL甲基丙酰氯及少量碳酸钠，于40℃下反应8h，制得表面键合有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；将1.9g模板分子胰蛋白酶溶解于65mL缓冲液中，加入9.8g单体对苯乙烯磺酸钠，使其相互作用30min，将溶液移入装有搅拌器、冷凝管和温度计的四口烧瓶中；加入0.5g改性微球MAO-CPVA，浸泡溶胀12h，然后再加入0.18g交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通N2气30min后升温至35℃，加入0.049g亚硫酸氢钠和0.098g过硫酸铵，使微球表面的接枝交联反应进行12h；结束反应后，将微球滤出，并用2mol/L氯化钠溶液充分洗脱模板胰蛋白酶，直到在洗脱液中检测不到胰蛋白酶分子为止，然后用蒸馏水冲洗干净，真空干燥后得到胰蛋白酶分子表面印迹微球MIP-PSSS/CPVA。实施例2在装有液体石蜡和span-60的四口烧瓶中，加入20mL聚乙烯醇与3mL的戊二醛，在65℃下反应6h，制得交联聚乙烯醇微球CPVA。将4g交联聚乙烯醇微球置于60mL丙酮溶液中，浸泡12h，使微球溶胀后加入5mL甲基丙酰氯及少量碳酸钠，于35℃下反应12h，制得表面键合有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；将1.6g模板分子胰蛋白酶溶解于50mL缓冲液中，加入8.5g单体对苯乙烯磺酸钠，使其相互作用30min，将溶液移入装有搅拌器、冷凝管和温度计的四口烧瓶中；加入0.35g改性微球MAO-CPVA，浸泡溶胀12h，然后再加入0.15g交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，通N2气30min后升温至30℃，加入0.037g亚硫酸氢钠和0.075g过硫酸铵，使微球表面的接枝交联反应进行10h；结束反应后，将微球滤出，并用2mol/L氯化钠溶液充分洗脱模板胰蛋白酶，直到在洗脱液中检测不到胰蛋白酶分子为止，然后用蒸馏水冲洗干净，真空干燥后得到胰蛋白酶分子表面印迹微球MIP-PSSS/CPVA。实施例3在装有液体石蜡和span-60的四口烧瓶中，加入25mL聚乙烯醇与2.8mL的戊二醛，在55℃下反应8h，制得交联聚乙烯醇微球CPVA。将3g交联聚乙烯醇微球置于50mL丙酮溶液中，浸泡12h，使微球溶胀后加入4mL甲基丙酰氯及少量碳酸钠，于45℃下反应6h，制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以对苯乙烯磺酸钠为单体的胰蛋白酶印迹微球的制备方法，其步骤如下：步骤一，在反相悬浮体系中以戊二醛为交联剂、聚乙烯醇为原料制得交联聚乙烯醇微球CPVA；步骤二，将交联聚乙烯醇微球CPVA置于丙酮溶液中，然后加入甲基丙烯酰氯使交联聚乙烯醇微球CPVA发生酯化反应，从而制得表面含有大量可聚合双键的改性微球MAO‑CPVA；步骤三，将胰蛋白酶和对苯乙烯磺酸钠溶于磷酸盐缓冲液中，使其作用一定时间形成主‑客体复合物溶液；步骤四，将改性微球MAO‑CPVA加入到步骤三的主‑客体复合物溶液中，然后再加入N,N′‑亚甲基双丙烯酰胺，在有氮气保护条件下使其发生交联共聚合反应，制备胰蛋白酶表面印迹微球；步骤五，将步骤四制备的印迹微球用氯化钠水溶液进行反复冲洗去除胰蛋白酶后用蒸馏水冲洗干净，然后真空干燥得到表面含有大量模板孔穴的胰蛋白酶表面印迹微球。

【技术特征摘要】
1.一种以对苯乙烯磺酸钠为单体的胰蛋白酶印迹微球的制备方法，其步骤如下：
步骤一，在反相悬浮体系中以戊二醛为交联剂、聚乙烯醇为原料制得交联聚乙烯醇微球CPVA；
步骤二，将交联聚乙烯醇微球CPVA置于丙酮溶液中，然后加入甲基丙烯酰氯使交联聚乙烯醇微球CPVA发生酯化反应，从而制得表面含有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；
步骤三，将胰蛋白酶和对苯乙烯磺酸钠溶于磷酸盐缓冲液中，使其作用一定时间形成主-客体复合物溶液；
步骤四，将改性微球MAO-CPVA加入到步骤三的主-客体复合物溶液中，然后再加入N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，在有氮气保护条件下使其发生交联共聚合反应，制备胰蛋白酶表面印迹微球；
步骤五，将步骤四制备的印迹微球用氯化钠水溶液进行反复冲洗去除胰蛋白酶后用蒸馏水冲洗干净，然后真空干燥得到表面含有大量模板孔穴的胰蛋白酶表面印迹微球。
2.根据权利要求1所述一种以对苯乙烯磺酸钠为单体的胰蛋白酶印迹微球的制备方法，其特征在于：步骤一中所述浓度为5%的聚乙烯醇溶液的体积百分比为2~5%，戊二醛的体积百分比为2~6%，反应温度为55~65...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，高保娇，史楠，
申请(专利权)人：中北大学，
类型：发明
国别省市：山西;14