马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR4322调控马铃薯APX基因(PGSC0003DMG400030063)，可用于研究该APX基因的功能，即通过缺失表达或过表达该APX时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR4322的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利涉及一种microRNA（miRNA）及其筛选方法和应用，具体地说是马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用。
技术介绍
miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，长约20nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA基因最初转录产生具有茎环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，通常在转录后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。干旱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，其对农作物的生长发育和产量造成极其严重的影响。据统计，地球上总土地面积的36%属于缺水的干旱或半干早区域，我国干旱和半干早区域大约占国土地面积的1/2。即使在半湿润和湿润的农业主产区，也通常会受到季节性和周期性的旱灾侵袭。干旱胁迫对农作物产量、质量的影响相当于其余自然灾害之和，其危害性在各种自然逆境胁迫中占首位，仅次于病虫害对作物造成的损失。解决干旱问题的途径，除了节水灌溉来提高水分的利用效率之外，就是培育节水抗旱的新品种以提高作物自身抵御干旱的能力。要达到这一目的，必须了解作物响应干旱胁迫的分子机制。因此，对作物抗旱机理的研究以探索提高作物抗旱能力是各国科学家关注的研究热点问题。尤其是近年来对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鉴定、克隆出大量耐旱相关的基因，已研究清楚了一些耐盐相关的基因的调控模式。将抗旱、耐盐基因通过基因工程的手段整合到目标植物基因组中或有目的的抑制或诱导一些干旱相关基因的表达来获得转基因植株，开辟了培育高度抗旱性作物新品种的新途径。随着对植物抗旱机理的了解以及转基因技术的日趋成熟，利用转基因技术来获得抗旱的育种材料或遗传改良的新品种，已成为抗旱品种培育最具发展潜力的方向。干旱等非生物胁迫往往会产生共同的次生胁迫，如氧化胁迫，会导致植物细胞的代谢不协调，细胞内过氧化物的过度积累，过度积累的活性氧将会攻击脂肪、核酸及蛋白质等大分子物质，产生大量的无功能蛋白垃圾，对植物造成的次生伤害。在逆境条件下，植物为了维持正常的生命代谢稳态，在漫长的进化过程中已经演化形成一套抵御逆境胁迫的作用机制。如APX是植物体内最为主要的过氧化物清除酶之一，也被认为是在叶绿体中清除H2O2的关键酶，有研究显示，转APX基因并过量表达的转基因烟草和拟南芥都表现出对氧化胁迫更强的耐受能力；同时也有研究发现过表达APX的转基因棉花具有较高的PSII光化学活性和较强的抗氧化能力，从而大大提高了转基因植株对逆境胁迫的适应能力。这可能是由于APX过量表达会保护Calvin循环防止了AsA被氧化。另外，最近通过研究了缺失APX的突变体也进一步证明了APX在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供马铃薯stu-miR4322的前体序列、stu-miR4322抑制靶基因表达以研究靶基因功能的应用、stu-miR4322抑制靶基因表达提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品种的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：马铃薯stu-miR4322的前体序列如下（本专利技术中所列核苷酸序列均为5′→3′）：ggguucgcuuggggccaguaauggucuccgagugccgguccagcccaggguguaggcucagggcgugacauccagaucacgcucugcaaggcccauucgaggguagca（序列表SEQIDNO：1）。马铃薯stu-miR4322的前体序列的二级结构式为：自5′端3bp-5bp和55bp-58bp形成环状，自5′端25bp-34bp形成环状；其他碱基配对形成茎环结构。编码上述马铃薯stu-miR4322的前体序列的DNA序列为：gggttcgcttggggccagtaatggtctccgagtgccggtccagcccagggtgtaggctcagggcgtgacatccagatcacgctctgcaaggcccattcgagggtagca（序列表SEQIDNO：2）。上述马铃薯stu-miR4322的成熟序列如下：cccaggguguaggcucagggcgug（序列表SEQIDNO：3）。stu-miR4322的成熟序列是前体序列自5′端44bp-67bp的一段RNA序列。上述马铃薯stu-miR4322的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR4322抑制靶基因APX基因(PGSC0003DMG400030063)的表达，所述APX基因序列如序列表SEQIDNO：4所示。上述马铃薯stu-miR4322的前体序列在培育抗旱转基因植物中的应用。优选地，所述转基因植物为马铃薯（Solanumtuberosum）。优选地，在马铃薯中过表达SEQIDNO：1所述miRNA，或者抑制SEQIDNO：1所述miRNA的表达，培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯。采用上述技术方案所产生的技术效果在于：本专利技术提供了一种马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR4322调控APX基因(PGSC0003DMG400030063)，可用于研究该APX基因的功能，即通过缺失表达或过表达该APX基因时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR4322的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。附图说明图1是本专利技术马铃薯stu-miR4322的二级结构图。图2是本专利技术马铃薯靶基因降解电泳图。图3是本专利技术马铃薯靶基因降解组测序图。图4是本专利技术马铃薯stu-miR4322的荧光定量PCR图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对具体实施方式进行详细说明。本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术，以下实施例仅仅示出了与根据本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本专利技术所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得；所有定量试验均设置三次重复试验，结果取平均值。实施例一：stu-miR4322和靶基因序列的确认马铃薯stu-miR4322的前体序列如下（本专利技术中所列核苷酸序列均为5′→3′）：ggguucgcuuggggccagua本文档来自技高网...

【技术保护点】
马铃薯stu‑miR4322，其特征在于所述stu‑miR4322的前体序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.马铃薯stu-miR4322，其特征在于所述stu-miR4322的前体序列如序列表SEQIDNO：
1所示。
2.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR4322，其特征在于编码所述stu-miR4322前体
序列的DNA序列如序列表SEQIDNO：2所示。
3.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR4322，其特征在于所述stu-miR4322的成熟序
列如序列表SEQIDNO：3所示。
4.根据权利要求3所述的马铃薯stu-miR4322，其特征在于所述stu-miR4322的成熟序
列是前体序列自5′端44bp-67bp的一段RNA序列。
5.马铃薯stu-miR4322的筛选方法，其特征在于所述stu-miR4322的制备方法包括如下
步骤：（1）马铃薯材料处理；（2）样品总RNA提取与检测；（3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江伟，周香艳，文义凯，司怀军，张宁，唐勋，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62