本发明专利技术涉及一种通过负压空化水提的方法，利用特异性树脂及硅胶柱层析纯化高效生产１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇的方法。以红豆杉枝叶为原料，干燥粉碎后进行负压空化水提，过滤后滤液经过ＡＢ－８树脂动态吸附对１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇进行富集，后经过中压硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为６０％以上的１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和６７％以上的７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇。本发明专利技术所用原料为可再生的红豆杉枝叶，既做到了不破坏生态资源，又能高效提取得到红豆杉有效成分及其生物半合成前体物质。该方法操作简单易行，适于工业应用，对产业化生产具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从红豆杉枝叶中提取纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖 基-10-去乙酰基紫杉醇的方法。
技术介绍
紫杉醇(paclitaxel，图l)是具有五甲基十五碳烯骨架的二砲类化合物，是最早 从太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中提取出来的一种天然抗癌药物(Wani et al., 1971)，能与微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细 胞的增殖(Kelling et al., 2003;佘琨等，2001)1992年被美国FDA正式批准为抗癌 新药，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的作用。近年来研究表明，紫杉醇 对治疗其它疾病也有一定潜力，如恶性黑色素瘤(罗士德等，1994)、类风湿性关 节炎(01iver et al., 1994)和早老性痴呆(Burke et al., 1994)等。随着国际市场上对紫 杉醇需求量的日益增长，野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏，人工种植红豆杉 己成为解决紫杉醇原料短缺的重要途径(刘颖和肖艳，2005;黄玉仙，2005;吉前 华，2004)，但如果采用传统方法，从红豆杉树皮中提取紫杉醇，资源耗费太大且 人工种植周期长，仍不能解决紫杉醇的原料问题。目前供临床使用的紫杉醇主要从红豆杉树皮中提取。紫杉醇在红豆杉植物中 含量很低，即使当前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有O.Ol % 0.03 %。为 了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾,多年来，科学工作者在寻找及扩大紫杉醇药源 途径方面做了不懈的努力。人们从以下几个方面进行了研究红豆杉细胞大规模 培养、全合成和半合成，产紫杉醇真菌的筛选和发酵培养,紫杉醇生物合成途径中 关键酶基因的克隆和工程菌的改造等。目前，人工种植的红豆杉数量逐渐增加，给紫杉醇的获得提供了新的来源， 但是红豆杉生长缓慢，环境适应性较弱，不能依靠人工种植的红豆杉树皮提取所 需的紫杉醇，因此，应该利用其可再生部位——枝叶，对其的枝叶进行充分的开 发利用。在许多紫杉属植物中，含有很多与紫杉醇结构相似的紫杉烷类化合物，含量 比紫杉醇丰富得多，这些紫杉烷类化合物可以通过生物或者化学转化的手段转变 成紫杉醇，例如10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇(图1)存在于多种 紫杉属植物中，例如T. 6rew》/fa, 77. 6accato, r. me&a, J! c/z/wera/s, ""t/ Z ow/^ato等，在紫杉属植物中的含量约为0.0052%~0.1185%。在C-7位连接有木 糖基的紫杉烷类化合物最初由Senilh分离得到，主要有7-木糖基-10-去乙酰基 紫杉醇，7-木糖基-10-去乙酰基三尖杉宁碱，7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇C等， 这些化合物在传统的提取紫杉醇的生产工艺中常被当作废物丢弃掉，既浪费了植 物资源，又污染了环境。和紫杉醇与多西紫杉醇比较，IO-去乙酰基巴卡亭III几 乎不具有任何抗癌活性，然而由于其结构与紫杉醇、多西紫杉醇相似，10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇可以用于紫杉醇与多西紫杉醇的半合成，因此，10-去乙酰基巴卡亭m和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇的制备型分离是在世界范围内的一个研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以红豆杉枝叶为原料，通过负压空化水提对其中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇进行提取，通过树脂富集和硅胶柱层析对io-去乙酰基巴卡亭m和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇进行纯 化的工艺方法。本方法不仅可以获得10-去乙酰基巴卡亭in和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇产品，还可提高植物固形物中紫杉醇等有效成分的后期提取纯化，增 加原料的利用度。一种从红豆杉枝叶中提取纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法，其主要特征在于红豆杉枝叶经过干燥粉碎后，于50 °C下进行负压空化水提30 min，过滤后滤液经过AB-8树脂动态吸附，用30%乙 醇进行淋洗除去杂质，再用80%乙醇洗脱得到目标产物，从而达到对10-去乙酰 基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的初步富集，后经过中压硅胶柱层 析进一步纯化，得到纯度为60%以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。按照权利要求1所述的红豆杉枝叶，其特征在于红豆杉枝叶主要来源包 括东北红豆杉和南方红豆杉。按照权利要求1所述的负压空化水提，其特征在于IO-去乙酰基巴卡亭III 和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇是水溶性较大的物质，通过负压空化水提，可 以将植物材料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇充分 提出，而将其它紫杉醇等大部分脂溶性的物质留在植物固形物中，可作为后期 提取紫杉醇的原料。通过负压空化提取，使得提取溶剂与植物细胞有了更充分的接触，促使植物细胞中的物质迅速彻底地转移至提取溶剂中，所用时间短， 效率高。按照权利要求1所述的树脂富集，其特征在于所用的树脂为AB-8。该树 脂对于10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇具有特异性吸附。 所用树脂为35 g，上样溶液为15 BV，流速为1 mL/min，温度为35 °C,采用梯 度洗脱的方法3 BV的30%乙醇洗脱除去杂质，然后6BV80。/。乙醇洗脱，收集 馏分，浓缩至干，经过树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙 酰基紫杉醇的含量可分别提高8.54倍以上和62.43倍以上。按照权利要求l所述的中压硅胶柱层析，其特征在于所用硅胶为300-400 目40g，柱高为14.5cm，，中压柱层析，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯与石 油醚的混合溶剂梯度洗脱，流速为4. 3 mL/min，洗脱过程中用TLC进行检测， 利用10°/。的硫酸乙醇溶液显色。先用600 mL乙酸乙酯/石油醚(1/1， v/v)洗 脱，淋洗除杂，用1.6 L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2， v/v)洗脱，收集含有IO-去乙酰基巴卡亭IH的馏分，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1， v/v)淋洗 除杂，最后用200 mL乙酸乙酯/石油醚(20/1， v/v)洗脱，收集含有7-木糖 基-10-去乙酰基紫杉醇的馏分。最终得到纯度为60%以上的10-去乙酰基巴卡亭 III和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。本专利技术的优点1. 本专利技术以红豆杉可再生枝叶为原料，不破坏植物资源，提取后的固形物可作为 提纯紫杉醇等有效成分的原料，实现了对植物资源的髙效利用。2. 本专利技术采用负压空化水提的方法对植物原料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇进行提取，时间短，效率高。3. 本专利技术所采用的AB-8树脂富集方法，对粗提取物中的10-去乙酰基巴卡亭III 和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇具有特异性吸附，可以高效地提高洗脱馏分中两 种物质的含量。4. 该方法简单易行，可实现大规模的产业化生产。 .具体实施方案实施例1称取200g南方红豆杉枝叶，干燥粉碎后，加入2000mL水负压空化提取， 3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从红豆杉枝叶中提取纯化１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇的方法，其主要特征在于：红豆杉枝叶经过干燥粉碎后，于５０℃下进行负压空化水提３０ｍｉｎ，过滤后滤液经过ＡＢ－８树脂动态吸附，用３０％乙醇进行淋洗除去杂质，再用８０％乙醇洗脱得到目标产物，从而达到对１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇的初步富集，后经过中压硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为６０％以上的１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ和６７％以上的７－木糖基－１０－去乙酰基紫杉醇。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付玉杰，祖元刚，孙蕊，李双明，王莹，姜守刚，汪琢，张琳，刘威，
申请(专利权)人：东北林业大学，付玉杰，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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