血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物及其检测方法和应用技术

本发明专利技术属于分析化学及临床医学领域，公开了血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物及其检测方法和应用。该标志物为癸酸和/或十二烷酸，采用UPLC‑Q exactive MS方法检测，该标志物可用于特发性男性不育的辅助诊断与监测，具有较高的灵敏度和特异度，具有临床推广价值。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于分析化学及临床医学领域，涉及血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物及其基于UPLC-QexactiveMS的检测方法和应用。
技术介绍
全世界约15％夫妇被不育所困扰，其中约50％为男性不育。男性不育的原因较多，同一患者可以有单一病因，亦可先后有2个不同或相关病因。然而，男性不育中仍有相当比例无法解释病因，称为特发性男性不育，给疾病诊疗带来了极大困难。WHO男性不育的标准是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，同居1年的诊断标准，大大耽误了对男性不育进行早期治疗和干预的时间；由于现实原因很多夫妻并不能保证严格的同居1年，使得最后的男性不育判断变得非常困难；而且为了排除女方原因，女方还需要进行详细的检查，带来了沉重的经济和医疗负担。传统的精液参数检查不能全面地反映精液的全部状况。因此，男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常，也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。除此之外因为受到禁欲时间等因素的影响，常规精液参数常规分析结果还表现为较大的波动性，临床诊断往往需要参考多次精液常规分析。因而，临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解小分子代谢在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)，可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。值得注意的是，血液是临床上容易获得的生物样本，具有低创和多项检查公用的优点。特别适合疾病的临床诊断和体检中的筛查。然而，采用代谢组学分析血清代谢小分子在特发性男性不育的诊断监测中的应用还未得到相应的关注。目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点。UPLC-QexactiveMS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-QexactiveMS进行血清的代谢组学分析，若能发现稳定的与特发性男性不育发病相关的特异血清代谢小分子作为生物标志物，并研发相应的代谢小分子标志的UPLC-QexactiveMS检测方法，将具有广泛的医学应用价值，为男性生殖健康造福。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物。本专利技术另一个目的是提供上述中链脂肪酸标志物的检测方法。本专利技术再有一个目的是提供检测上述中链脂肪酸标志物的试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的：血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物，该标志物为血清中的癸酸和/或十二烷酸。所述的中链脂肪酸标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用。一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，该试剂盒含有检测血清中癸酸和/或十二烷酸的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测血清中癸酸和/或十二烷酸的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：癸酸和十二烷酸标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标(氘标，水溶液)；内标B：十五烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)；内标C：二十四烷酸的同位素内标(氘标，甲醇溶液)。进一步，该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：沉淀蛋白用，含100％甲醇；试剂B：流动相用，含0.1％的甲酸的水；试剂C：流动相用，含0.1％的甲酸的乙腈；试剂D：复溶用，超纯水。一种检测如前所述的血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物的方法，该方法采用UPLC-QexactiveMS方法，检测血清中癸酸和十二烷酸含量。上述检测方法中：一、液相条件：液相色谱柱为HypersilGOLDC18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈，流速为400μL/min；仪器梯度为：0-3min1％B，3-10min1％到99％B，10-13min99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min1％B；(B指流动相B，各梯度中流动相A的量与对应的流动相B的量共100％，下同)进样方式：体积5μl；二、质谱条件采用加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V；采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。本专利技术详细描述如下：本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血清样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-QexactiveMS的代谢组学方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据第一阶段筛选阶段随机纳入明确诊断的特发性男性不育113人和健康对照113人，共226人。A组：健康对照组(113人)：1.年龄在19至38岁之间；2.体质指数大部分在17至31之间；3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；4.无全身重大疾病。B组：特发性男性不育疾病组(113人)：1.年龄与对照组匹配；2.体质指数与对照组匹配；3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；4.无明确男性不育病因；5.吸烟饮酒史与对照组匹配；6.民族与对照组匹配；7.无全身重大疾病。第二阶段验证阶段纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人，共30人。A组：健康对照组(15人)：1.年龄在24到36岁之间；2.体质指数在19至24之间；3.生殖能力健康的男性，而且6-8个月后有了健康的后代；4.无全身重大疾病。B组：特发性男性不育疾病组(15人)：1.年龄与对照组匹配；本文档来自技高网...

【技术保护点】
血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物，其特征在于该标志物为癸酸和/或十二烷酸。

【技术特征摘要】
1.血清中与特发性男性不育相关的中链脂肪酸标志物，其特征在于该标志物为癸酸和/或十二烷酸。2.权利要求1所述的中链脂肪酸标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用。3.一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测血清中癸酸和/或十二烷酸的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测血清中癸酸和/或十二烷酸的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列试剂：癸酸和/或十二烷酸标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标；内标B：十五烷酸的同位素内标；内标C：二十四烷酸的同位素内标。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：100％甲醇；试剂B：含0.1％的甲酸的水；试剂C：含0.1％的甲酸的乙腈；试剂D：超纯水。7.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏健，夏彦恺，陆春城，肖甜，胡艳辉，周作民，陈道桢，吴笛，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32