用于核酸检测的SERS传感器及其制备和多元检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于核酸检测的SERS传感器及其制备和多元检测方法，该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成，核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面，与目标核酸分子碱基互补配对后，通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化，实现对核酸的传感检测，基片表面的裸露位点用巯基己醇封闭。所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。所述的核酸探针链3’端修饰巯基，5’端修饰染料分子，探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构，部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。该传感器检测限达到飞摩尔级（fM），可实现多种核酸标志物的联合检测。本发明专利技术公开的传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好，在肿瘤早期诊断等领域有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于核酸检测的SERS(表面增强拉曼散射)传感器及其制备方法和多元检测方法。
技术介绍
近年来研究证明miRNA的表达失控与肿瘤的发生发展密切相关，miRNA在特定组织及特定发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，这就决定了miRNA在疾病诊断中的重要作用。然而在病变的早期这些肺癌标志物含量很低，常规临床检测技术因其灵敏度的限制，容易对标志物产生漏检；而且至今尚未发现敏感度和特异性俱佳的单一肺癌标志物；此外，肿瘤标志物检测的样本一般是血液或组织，通常成分复杂，测试结果易受干扰，影响检测可靠性。针对肿瘤早期发现这一关键性问题，迫切需要发展便捷、灵敏、价格低廉的高灵敏检测新方法，对多种肺癌标志物实行联合检测。目前已公开的用于核酸检测的表面增强拉曼散射传感器比较少，针对血清中多元核酸标志物联合检测的方法还比较匮乏。因此，开发用于核酸标志物检测，尤其是痕量肿瘤核酸标志物检测的高性能SERS传感器，用于多种肿瘤miRNA标志物的联合检测是迫切需求。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于核酸检测的表面增强拉曼散射(SERS)传感器及其制备方法和多元检测方法。该传感器以银纳米棒阵列型SERS基片为载体，经表面修饰特定核酸探针链构建得到，本专利技术同时提供了利用该核酸传感器的多元检测方法。本专利技术采用的技术方案为：用于核酸检测的SERS传感器，该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成，核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面，与目标核酸分子碱基互补配对后，通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化，实现对核酸的传感检测。基片表面的裸露位点用巯基己醇封闭。所述固体SERS基片为银纳米棒阵列型基片。所述的核酸探针链3’端修饰巯基，5’端修饰染料分子，探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构，部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。所述染料分子为本领域常规的标记染料，包括但不限于ROX、Cy5、FAM等染料。所述核酸探针链的浓度优选为1uM。核酸探针链和目标核酸分子数量相等，每个核酸探针链对应一个目标核酸分子，构成一组互补杂交双链结构。所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法，包括如下步骤：1)制备固体SERS基片，然后用纯水多次冲洗；2)取核酸探针链滴于固体SERS基片与固体SERS基片共培养，然后用缓冲液冲洗干净；修饰探针链的SERS基底在缓冲液中浸泡，使DNA形态保持稳定；3)用巯基己醇封闭基片表面裸露的位点，并用缓冲液轻轻冲洗干净，制备得到核酸检测SERS传感器。步骤2)中所述共培养条件为在25℃，80％湿度环境中静置培养3h。步骤2)中浸泡时间为10～30min。所述的SERS传感器检测核酸的多元检测方法，将SERS传感器与待测样品溶液共培养后，用缓冲液冲洗进行SERS测试得到SERS信号，对照工作曲线计算得出待测样品中目标核酸的浓度。所述工作曲线是将SERS传感器分别与含有多种目标核酸的不同浓度血清样品溶液共培养，得到不同浓度样品检测的SERS信号强度，以核酸浓度为横坐标，以SERS信号强度变化量为纵坐标做出工作曲线。所述SERS传感器与待测样品溶液共培养条件为：在37℃，杂交反应2h。本专利技术传感器基于银纳米棒阵列型SERS基片制作得到，首先选择特定的检测探针链，该探针链为可以与待检测核酸分子进行碱基互补配对，具有发卡型结构且带有染料分子的核酸片段，然后将上述探针链固定在银纳米棒阵列基片表面制备得到核酸SERS传感器。将待检测核酸滴加到上述传感器并培养，通过检测染料分子的SERS信号及其强度实现对待检测核酸的定性定量检测。本专利技术中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法按文献(C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modifiedsilvernanorodarrays:growthdynamicsandimprovedSERSproperties.JournalofMaterialsChemistry,2012,22(3):1150-1159.)中报到的方法制备。本专利技术SERS传感器可以用于单元、双元及多元检测核酸，根据探针种类来实现混合核酸的检测。以检测肺癌核酸标志物microRNA-21、microRNA-486和microRNA-375为示例制备用于三元检测的核酸SERS传感器。所述示例的3种检测核酸碱基序列为：microRNA-21：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’microRNA-486：5'-UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG-3'microRNA-375：5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’所述示例的3种发卡型探针链对应的核酸片段碱基序列为：探针链1：5’-ROX-CCGTTCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’；探针链2：5’-Cy5-CCGTTCTACTCGGGGCAGCTCAGTACAGGATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’；探针链3：5’-FAM-CCGTTCTATCACGCGAGCCGAACGAACAAATAGAACGGTTTTT-(CH2)6-SH-3’。本专利技术制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中，核酸探针链3’端修饰巯基，5’端修饰染料分子ROX、FAM或者Cy5，探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构，部分碱基序列与待检测核酸可互补配对。探针链通过金-硫键固定于银纳米棒阵列型SERS基底的表面，基底表面的裸露位点用巯基己醇封闭。本专利技术制备用于核酸检测的SERS传感器的优选方案中，发卡型核酸探针链和目标核酸(待检测)分子部分碱基互补，每个发卡型核酸探针链均对应与一个目标核酸分子互补杂交，构成一组互补杂交双链结构。互补配对后，探针链的发夹型茎环打开，5’端修饰的染料分子远离SERS基底。本专利技术中制备上述用于核酸检测的SERS传感器，包括如下具体步骤(以三元检测传感器为例)：(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗；(2)将探针链1(1uM)、探针链2(1uM)和探针链3(1uM)分别进行高温冷却处理，即在95℃恒温摇床中保持5min，再在4℃冰箱保持20min，用于提纯发卡型DNA链；(3)取三种核酸探针链(1uM)各20uL分本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于核酸检测的SERS传感器，其特征在于，该传感器由固体SERS基片和核酸探针链构成，核酸探针链通过金‑硫键固定于固体SERS基片的表面，与目标核酸分子碱基互补配对后，通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化，实现对核酸的传感检测。

【技术特征摘要】
1.用于核酸检测的SERS传感器，其特征在于，该传感器由固体SERS基片和核酸探针链
构成，核酸探针链通过金-硫键固定于固体SERS基片的表面，与目标核酸分子碱基互补配对
后，通过检测探针链上拉曼分子的SERS信号变化，实现对核酸的传感检测。
2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器，其特征在于，所述固体SERS基片
为银纳米棒阵列型基片。
3.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器，其特征在于，所述的核酸探针链
3’端修饰巯基，5’端修饰染料分子，探针链中部分碱基序列互补可形成发卡型结构，部分碱
基序列与待检测核酸可互补配对。
4.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器，其特征在于，核酸探针链和目标
核酸分子数量相等，每个核酸探针链对应一个目标核酸分子，构成一组互补杂交双链结构。
5.权利要求1所述的用于核酸检测的SERS传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步
骤：
1）制备固体SERS基片，然后用纯水多次冲洗；
2）取核酸探针链滴于固体SERS基片与固体SERS基片共培养，然后用缓冲液冲洗干净；
修饰探针链的SERS基底在缓冲液中浸泡，使DNA形态保持稳定；
3）用巯...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春元，汪联辉，杨琰君，杨博玥，苏邵，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32