一种利用硫酸寡糖组鉴别北极刺参的方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合及检测方法，利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱-质谱联用技术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5μg。质谱还能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种鉴别北极刺参的方法。
技术介绍
海参富含硫酸多糖、蛋白质，皂苷、矿物质，且不含胆固醇，故享有“营养宝库”之美誉。目前市场上海参种类繁多，良莠不齐，不同海参因其营养价值、口感不同而价格相差巨大。目前鉴别海参种类的方法只是传统的外观和骨片观察，误差比较大，缺乏技术水平的支持。在海参牛奶、海参饮液中，缺少分析海参的种类的方法，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者。而且目前市面上出现了使用海藻粉或魔芋粉制成的假海参，没有海参特有的营养成分。因此需要一种高效准确的鉴定海参品种的分析方法。海参中含有两种独特的硫酸多糖，主要为具有岩藻糖支链的硫酸软骨素和直链岩藻聚糖硫酸酯，占海参干重的4％左右，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。这两种硫酸多糖结构复杂，因海参的种类和生长海域不同而有差别，可以作为鉴别海参种类的目标化合物。采用化学方法分析海参硫酸多糖的结构，传统的方法主要采用NMR分析，但是要求硫酸多糖的纯度高、样品量大。海参硫酸多糖的分析需要进行离子交换色谱纯化、降解、凝胶柱纯化和脱盐等多步复杂的分离纯化步骤，一个样品总共需要近20天的时间才能完成。而且这些硫酸多糖分子量大、组成复杂，所以NMR吸收峰重叠，无法鉴别不同海参来源的硫酸多糖细微的结构区别。因此迫切需要一种更加快速简便、分辨率高的检测海参硫酸多糖的分析方法。
技术实现思路
本专利技术对北极刺参的硫酸寡糖进行了研究，建立了从硫酸寡糖水平对北极刺参进行鉴别的技术，从而弥补了现有技术的不足。本专利技术首先提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，所述的寡糖组合，其中第一组合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1-4；第二组合为(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)、(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-6)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝5-7)。本专利技术还提供一种检测北极刺参的方法，所述方法包括以下步骤：1)对待侧样本进行液相色谱-质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；2)通过液相色谱-质谱联用法检验待测样本的硫酸寡糖成分，分析样本中的北极刺参成分。所述的液相色谱-质谱前处理步骤如下：1)固体干海参粉碎成粉末状态，加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0，15mmol/LEDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸)、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解24h；将反应物沸水浴5min灭酶活后离心，取上清液；2)取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；3)将步骤2)收集的沉淀用添加了NaCl的乙醇溶液(3mol/LNaCl，86％乙醇)溶解后，加入95％乙醇，4℃下放置24h，离心后，收集沉淀，完成海参硫酸多糖的提取；4)将海参硫酸多糖溶于0.5mol/LNa2HPO4溶液中，加入醋酸铜溶液和H2O2，60℃水浴降解3h；然后用NaOH调节溶液至pH9.0，离心后，取上清液；5)采用1kDa的滤膜4000×g超滤10min，收集上层的滤液，完成海参硫酸寡糖溶液的制备，待上机检测。所述的液相色谱-质谱联用法检测，色谱条件如下：色谱柱：LunaHILIC柱(2.0×150mm，5μm)，流动相A：5mM醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，进样量为4μL，流动相A的洗脱梯度是10％-35％，0-40min洗脱，流速150μL/min；质谱的条件：负离子模式，电喷雾源，质量分析器为Orbitrap-傅里叶转换，负离子电力模式，毛细管电压-40V，套管透镜补偿电压-50V，毛细管温度设为275°层流量为30，辅助气体的流量6，扫描分子量300-1000u，Xcalibur质谱软件中处理。所述的分析样本中的北极海参成分，是将待测样品的质谱结果对比上述组合的寡糖的质谱谱图，同时出现上述寡糖组合的各条特异性的硫酸寡糖的质谱检测谱图时，可以判断该组织样品为北极刺参样本。本专利技术的方法利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱-质谱联用技术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5μg。质谱还能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。附图说明图1，(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、图2，(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、图3，(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、图4，GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、图5，(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、图6，北极刺参寡糖的液相色谱-质谱联用分析的总离子流图、图7，目标寡糖在北极刺参中的质谱图、图8，(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图、图9，(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在液相色谱-质谱联用分析图、图10，(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析图、图11，GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)液相色谱-质谱联用分析图、图12，(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在液相色谱-质谱联用分析图。具体实施方式本专利技术利用液相色谱-质谱联用技术检测北极刺参的硫酸寡糖的全指纹图谱，对比仿刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参来源的硫酸寡糖，鉴别出两组硫酸寡糖为北极刺参特有的。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1，北极刺参来源特异的硫酸寡糖的结构和对比信息1.北极刺参独本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，其特征在于，所述的寡糖组合，其中第一组合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1‑4；第二组合为(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2‑3)、(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1‑4)、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4‑6)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4‑7)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝5‑7)。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，其特征在于，所述的寡糖组合，其中第一组
合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1-4；第二组合为(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)、
(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-6)、
(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝5-7)。
2.权利要求1所述的硫酸寡糖组合在检测北极刺参中的应用。
3.一种检测北极刺参的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)对待侧样本进行液相色谱-质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；
2)通过液相色谱-质谱联用法检验待测样本的硫酸寡糖成分，分析样本中的北极刺参
成分，检测是否出现权利要求1所述的硫酸寡糖组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱-质谱前处理包括如下的步
骤：
1)固体干海参粉碎成粉末状态，加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0，15mmol/L
EDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸)、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解24h；将反应物沸水浴5min
灭酶活后离心，取上清液；
2)取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；
3)将步骤2)收集的沉淀用添加了NaCl的乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雪，胡靖，李八方，张鸿伟，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37