通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法，在糖多孢红霉菌中，通过基因工程途径缺失TetR家族转录调节基因SACE_3980，获得红霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产红霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法。
技术介绍
红霉素是由糖多孢红霉菌次级代谢产生，属于典型的聚酮类抗生素，其组分包括红霉素A(Er-A)、红霉素B(Er-B)、红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、红霉素E(Er-E)和红霉素F(Er-F)等。该类抗生素有广谱抗菌作用，其抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性菌有较强的抑制作用。红霉素各组分中临床上广泛应用的是红霉素A，它的抑菌活性最高，而红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)也被广泛用来治疗感染性疾病，红霉素及其衍生物每年的销售额达数百亿美元。红霉素在医药领域具有重要作用，但其产率仍有待提高。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济，不适合广泛应用。而通过基因工程的方法，在糖多孢红霉菌染色体中增加合成基因的拷贝数，或通过基因敲除的方法改造调控基因来获得红霉素高产菌株，有着很好的前景。2003年Rodriguez等报道红霉素高产主要是由于其调控基因，而不是合成基因，更使我们将研究重点转向调节基因。2005年，Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Coldshock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性，广泛参与调控多药抗性、抗生素合成、渗透性应激反应等生物活动。近年来报道了多种参与抗生素或链霉菌形态分化的TetR家族转录调控子，比如SCO1712，SAV151，SAV576，jadY，atrA等，暗示着TetR家族调控基因在链霉菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。糖多孢红霉菌全基因组中有101个TetR家族基因，然而关于糖多孢红霉菌次级代谢TetR家族调控基因研究依然很少，报道的仅有参与调控糖多孢红霉菌形态分化的调控基因SACE_7040、SACE_0012和调控红霉素合成代谢基因SACE_5599、SACE_3986，SACE_3446，SACE_7301等，且对于其调节红霉素产量的精确机制阐明的还未清楚。
技术实现思路
本专利技术目的就是通过缺失糖多孢红霉菌中负调控基因SACE_3980，通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法，其特征在于：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法，其特征在于所述的SACE_3980基因产物可以负向调控红霉素生物合成。SACE_3980基因在工业菌株中的应用，其特征在于：在工业高产菌株中缺失TetR家族转录基因SACE_3980，获得高产突变株，可用于红霉素生产。本专利技术的优点是：本专利技术研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_3980，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3980基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3980基因时红霉素产量提高了29.3％，而在ΔSACE_3980缺失突变株中回补SACE_3980基因，红霉素产量得到恢复，表明SACE_3980是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。利用工业高产菌株WB作为出发菌株，在其染色体上缺失SACE_3980基因，使红霉素产量提高15.8％，说明缺失SACE_3980基因提高红霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。附图说明图1：SACE_3980基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息；图2：本专利技术的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR鉴定，(A)ΔSACE_3980突变体构建示意图，(B)ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定：SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp；M,5000bpDNAMarker；图3：出发菌株A226及缺失突变株ΔSACE_3980的抑菌分析及红霉素A每日产量分析，(A)A226出发菌株和ΔSACE_3980突变株发酵液的抑菌分析，(B)出发菌株A226和缺失突变株ΔSACE_3980六天红霉素A产物的HPLC分析；图4：SACE_3980基因回复、过表达菌株的构建及红霉素A产量分析，(A)A226/pIB139-3980回补、过表达菌株的PCR鉴定:PCR产物为apr抗性基因(776bp)；M,5000bpDNAMarker，(B)出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_3980、缺失回补菌株及回补空载对照菌株、过表达菌A226/pIB139-3980及过表达空载对照菌株红霉素A的HPLC分析；图5：SACE_3980基因对菌株形态分化的影响及ΔSACE_3980突变株生物量的测定，(A)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况，其中1：A226菌株，2：ΔSACE_3980突变株，3：回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980，4：过表达菌株A226/pIB139-3980，(B)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定。图6：红霉素工业高产菌株WB/SACE_3980缺失突变株的构建及红霉素A产量分析，(A)WB/ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定：SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp；M,5000bpDNAMarker，(B)高产菌株WB及缺失突变株WB/ΔSACE_3980红霉素A产量的HPLC分析。具体实施方式实施例11.1菌株、质粒与生长条件试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2％琼脂的R3M平板上培养。1.2材料、DNA操作与测序PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。表1研究中所用的菌种和质粒表2本专利技术构建合成的引物1.3SACE_3980基因缺失突变体的构建试验中合成的引物序列见表2。pUCTSR质粒是在pUC18的BamHI和SmaI酶切位点之间插入1360bp的硫链丝菌肽抗性基因(tsr)。为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_3980基因，分别用3980-P1/3980-P2和3980-P3/3980-P4为引物、糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_3980基因的上、下游各约1.5kb的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法，其特征在于：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

【技术特征摘要】
1.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法，其特征在于：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。2.根据权利要求1所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张部昌，任少华，汪焰胜，吴杭，王春宇，王浩，高娟子，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34